不同鋅源對肉仔雞腸道形態(tài)及金屬硫蛋白表達(dá)的影響

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 鄭立鑫 劉華偉 吳鵬華

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 劉大森＊

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 仝 泳

傳統(tǒng)上用于雞飼料中鋅元素的補充多以無機硫酸鋅為主，但其存在生物利用率低，易與飼料中其他營養(yǎng)素產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，含結(jié)晶水多易潮解等缺點。為解決這些問題，人們對各種形式的硫酸鹽替代品進(jìn)行了探索研究，其中，氨基酸螯合鋅以穩(wěn)定性強、利用率高、環(huán)境污染小等優(yōu)點備關(guān)注（李素芬等，2001；武書庚等，2001）。本試驗選取硫酸鋅和市場常見的3種氨基酸螯合鋅，根據(jù)腸道形態(tài)、金屬硫蛋白（MT）含量及其在小腸的相對表達(dá)量研究了不同鋅源對AA肉仔雞的影響，旨在為肉仔雞鋅添加劑選擇和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗選用1種無機鋅和3種氨基酸螯合鋅。無機鋅：硫酸鋅（ZnSO4），ZnSO4含量大于99.50%，鋅含量40.03%，購于天津博迪化工有限公司。氨基酸螯合鋅：蛋氨酸鋅（Met-Zn），Met-Zn含量大于79.00%，鋅含量17.50%；賴氨酸鋅 （Lys-Zn），Lys-Zn含量大于 58.00%， 鋅含量10.50%；甘氨酸鋅 （Gly-Zn），Gly-Zn含量大于66.00%，鋅含量29.00%，3種螯合鋅源均由廣東天科有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計與飼糧 選取480只商品代1日齡發(fā)育良好的AA肉公雞 （購于哈爾濱德林雞場），采用單因子完全隨機設(shè)計，隨機分成4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞。試驗選用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧（含鋅量為22.68 mg/kg），參照美國NRC（1994）中家禽營養(yǎng)需要量中肉仔雞營養(yǎng)建議量配制（表1）。在基礎(chǔ)飼糧中分別加入Zn-SO4、Lys-Zn、Met-Zn 和 Gly-Zn， 配制成 4 種含鋅量均為90 mg/kg試驗飼糧，以ZnSO4組為對照組。動物試驗管理按《AA肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進(jìn)行。自由采食、飲水，24 h光照，試驗期為21 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 樣品采集與處理 21日齡試驗結(jié)束后，每個重復(fù)選取2只肉雞，每個處理12只，共48只。將雞全部處死，立即摘取十二指腸、空腸和回腸中間部位5 cm，外翻后用滅菌生理鹽水沖洗，再用滅菌載玻片刮下各腸段黏膜于Ep管中，-80℃冷凍保存，以備檢測MT mRNA表達(dá)量；同時摘取肝、胰放于自封袋中-80℃凍存用于分析MT含量。然后摘取另1只雞的十二指腸、空腸、回腸用滅菌生理鹽水洗去食糜，置于10%甲醛中保存，用于制備小腸形態(tài)觀測切片。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 小腸形態(tài) 取在10%甲醛溶液中固定24 h的小腸組織，按步驟依次進(jìn)行水洗、透明、浸蠟、包埋處理，然后在室溫下進(jìn)行切片并染色封片。在美國moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)100倍下攝片，采用Motic Images Advanced 3.2病理圖像分析系統(tǒng)測量十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度（VH）、隱窩深度（CD），并計算兩者比值（V/C）。 其中絨毛高度以腸腺開口至絨毛頂端的垂直高度為準(zhǔn)，隱窩深度以黏膜肌層至腸腺開口處的垂直高度為準(zhǔn)。

1.4.2 小腸MT mRNA RNA的提取按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。用紫外分光光度計測定所提RNA在260 nm和280 nm的吸光度值，通過OD（260/280）值檢測RNA純度，并利用瓊脂糖凝膠電泳成像分析系統(tǒng)檢測總RNA完整性。檢測后立刻對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-80℃冷凍保存待用。隨后按照試劑盒說明書要求進(jìn)行熒光定量PCR操作。RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR所用試劑盒均購于大連寶生物有限公司，所需引物（表2）由上海生工合成。采用2–△Ct值法算出相對表達(dá)量。

表2 引物的設(shè)計與合成

1.4.3 肝、胰MT含量 MT含量測定參照成廷水（2004），采用鎘血紅蛋白親和力分析法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步整理。然后采用SPSS 17.0版統(tǒng)計軟件中ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，試驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋅源對肉仔雞小腸形態(tài)的影響 由表3可知，不同鋅源對3周齡肉仔雞小腸形態(tài)影響無顯著差異（P>0.05）。與對照組相比，3種氨基酸螯合鋅組十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度均有升高趨勢，而隱窩深度均有降低趨勢。

2.2 鋅源對肉仔雞小腸MT mRNA相對表達(dá)量的影響 提取的總RNA經(jīng)分析測定，計算得其OD值均在1.8～2.0。對總RNA進(jìn)行1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測，結(jié)果滿足后續(xù)試驗要求。從管家基因 （β-actin基因）與MT基因熒光定量PCR產(chǎn)物擴增曲線和溶解曲線圖可以看出，無非特異性產(chǎn)物形成，結(jié)果表明PCR擴增片段均為單一特異性產(chǎn)物。

表3 不同鋅源對肉雞腸道形態(tài)的影響

由表4可知，Gly-Zn組和Met-Zn組十二指腸、空腸和回腸中MT mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05），但Lys-Zn組與對照組差異不顯著 （P＞0.05）；在3種氨基酸螯合鋅中，Lys-Zn組十二指腸MT mRNA相對表達(dá)量顯著低于其他兩種螯合鋅組（P＜0.05）；在空腸和回腸中的表達(dá)則與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同鋅源對小腸MT mRNA相對表達(dá)量的影響

2.3 鋅源對肉仔雞肝、胰MT含量的影響 由表5可知，Gly-Zn組和Met-Zn組胰臟MT含量顯著高于Lys-Zn和ZnSO4組，分別較對照Zn-SO4組提高 32.21%（P＜0.05）和 26.54%（P＜0.05）。Lys-Zn組較對照組提高 8.27%（P＞0.05），但差異不顯著。不同鋅源對肝臟MT含量變化無顯著影響（P>0.05）。

3 討論

3.1 鋅源對肉仔雞小腸形態(tài)的影響 小腸是動物機體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，小腸絨毛高度與隱窩深度是衡量小腸吸收能力的重要指標(biāo)。Ewtushik等（2000）研究表明，小腸絨毛高度（V）與上皮細(xì)胞數(shù)量成顯著的正相關(guān)，絨毛高度增加，則上皮細(xì)胞數(shù)量增多，吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力增強。隱窩深度（C）則能夠反映上皮細(xì)胞的成熟度和增殖率，隱窩變淺，則細(xì)胞成熟度增強，吸收養(yǎng)分能力增強。兩者比值（V/C）能夠綜合反映小腸吸收能力，比值升高則吸收能力增強。Tako等（2005）研究表明，鋅能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而改善小腸形態(tài)。因此，通過對小腸形態(tài)的測定能夠在一定程度上反映出小腸對鋅的吸收能力。趙潤梅（2010）研究表明，與 ZnSO4相比，Met-Zn能夠增加小腸絨毛高度、降低隱窩深度。馮江（2011）研究表明，Gly-Zn能改善小腸形態(tài)，但與ZnSO4間差異不顯著。本試驗中，與無機對照組相比，氨基酸螯合鋅有增加小腸絨毛高度、減小隱窩深度的趨勢，與上述研究結(jié)果大體一致。說明氨基酸螯合鋅對肉仔雞小腸形態(tài)的作用效果略優(yōu)于無機鋅。但試驗中氨基酸螯合鋅與無機鋅間的差異并不顯著，則可能因為試驗各組鋅的添加水平相同，而試驗期又相對較短，肉仔雞小腸絨毛高度、隱窩深度對鋅源間差異的反應(yīng)并不敏感，因此對小腸形態(tài)的改善作用并未能夠完全體現(xiàn)出來。

表5 不同鋅源對肝、胰MT含量的影響μg/g

3.2 鋅源對肉仔雞小腸MT mRNA相對表達(dá)量的影響 MT是一種富含半胱氨酸的小分子量金屬結(jié)合蛋白，其特點是可以高親和力與重金屬結(jié)合。在雞組織中，每個MT能夠與7個鋅原子結(jié)合，對鋅的轉(zhuǎn)運、貯存和分布發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。鋅則能夠在轉(zhuǎn)錄水平上有效調(diào)控MT的基因表達(dá)，影響腸道MT的吸收效率（Davis等，1998）。虞澤鵬（2005）研究了同等鋅添加水平的Met-Zn與ZnSO4對小鼠腸道MT mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Met-Zn組的相對表達(dá)量顯著高于ZnSO4組。于昱（2008）在研究有機鋅的吸收機制時發(fā)現(xiàn)，不同鋅源對肉仔雞腸道MT mRNA表達(dá)量的影響差異顯著，弱絡(luò)合強度氨基酸鋅的相對表達(dá)量顯著高于硫酸鋅。本試驗中，3種氨基酸螯合鋅在十二指腸、空腸及回腸中MT mRNA的相對表達(dá)量均高于無機對照組，且Gly-Zn和Met-Zn組與對照組間差異顯著，與上述研究結(jié)果大體一致。說明氨基酸螯合鋅的環(huán)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更好，能夠有效避免小腸內(nèi)一些理化因子的干擾，使鋅更易被轉(zhuǎn)錄因子利用而用于MT的轉(zhuǎn)錄。由此可以看出機體對螯合鋅的利用效率更高。本試驗中Lys-Zn在十二指腸中MT mRNA表達(dá)量顯著低于其他兩種螯合鋅，原因可能與3種氨基酸螯合鋅分子量大小不同有關(guān)，由于Lys-Zn的分子量較大，導(dǎo)致其通過小腸黏膜效率低于其他兩種螯合鋅，因而造成MT mRNA的相對表達(dá)量低于Gly-Zn和Met-Zn。

3.3 鋅源對肉仔雞肝、胰MT含量的影響 在肝臟和胰臟中，鋅的主要貯存形式為同金屬硫蛋白（MT）結(jié)合。而MT含量對飼糧鋅變化的反應(yīng)非常敏感。因此，很多試驗研究把肝、胰MT含量的變化作為評定鋅吸收利用效果的重要指標(biāo)。馮江（2011）研究表明，Gly-Zn能夠顯著提高胰臟MT含量。劉澤輝（2011）研究得出，有機鋅和ZnSO4間的肝臟MT含量差異不顯著。本試驗研究結(jié)果表明，4種鋅源對肝臟MT含量變化無顯著影響，但Gly-Zn和Met-Zn能夠顯著提高胰臟MT含量，與上述研究結(jié)果大體一致。說明胰臟MT含量變化能夠成為反應(yīng)不同鋅源利用效果的敏感指標(biāo)，由結(jié)果可以看出Gly-Zn和Met-Zn的利用效果更好。Rojas等（1995）研究表明，Zn-Lys飼喂的山羊肝臟MT含量顯著高于無機鋅組。曹家銀等（2003）試驗表明，氨基酸鋅能顯著提高肝臟MT含量。本試驗中肝臟MT含量的差異并不顯著，與上述研究結(jié)果不一致，這可能因為肝臟MT含量隨飼喂時間的延長而導(dǎo)致作用敏感性降低，試驗中長時間飼喂高劑量鋅（90 mg/kg）很可能降低了肝臟MT的敏感性。另外，MT含量的變化還受到鋅源之外其他因素的干擾（鋅水平、動物應(yīng)激、動物差異等）。因此，所得試驗結(jié)果變化差異較大，有待后續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，Gly-Zn與Met-Zn能夠顯著提高小腸MT mRNA表達(dá)量和胰臟MT含量，可有效促進(jìn)鋅的吸收與利用，相比ZnSO4和Lys-Zn，在肉仔雞體內(nèi)作用更高效。

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