磺胺類藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌作用及與其他抗結(jié)核藥物相互作用的研究

于霞 趙立平 姜廣路 馬異峰 黃海榮

結(jié)核病疫情的不斷蔓延是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，目前全球已有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，而活動(dòng)性結(jié)核病患者達(dá)1500萬例，每年新增結(jié)核病患者約800～1000萬例，每年有180萬例因結(jié)核病死亡［1］。耐多 藥結(jié)核病 （multidrug－resistant tuberculosis，MDR－TB）是指體外至少對(duì)異煙肼（H）和利福平（R）同時(shí)耐藥的結(jié)核病。MDR－TB的治療與普通結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)一線藥物治療相比，治療效果差，不良反應(yīng)多且治療費(fèi)用高，已經(jīng)成為成功控制結(jié)核病的障礙。

磺胺是最早發(fā)現(xiàn)的具有抗菌作用的藥物，磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，SMX）又稱新諾明（sinomine），是磺胺類藥物中常用的抗生素，通常與甲氧芐啶（trimethoprim，TMP）聯(lián)合用于臨床治療。SMX和TMP均作用于細(xì)菌的葉酸合成途徑，SMX作用于二氫喋呤合成酶，從而阻止其將對(duì)氨基苯甲酸催化成二氫葉酸，而TMP則作用于二氫葉酸還原酶，從而阻止其將二氫葉酸還原成四氫葉酸［2］。目前，廣泛使用的復(fù)方新諾明就是TMP和SMX的復(fù)方制劑，其中SMX的含量為TMP的5倍。早在20世紀(jì)30—50年代，磺胺類藥物就單獨(dú)用來治療肺結(jié)核。但隨著20世紀(jì)50年代具有更強(qiáng)殺菌效果的H和鏈霉素（S）出現(xiàn)后，磺胺類藥物就基本不再用于結(jié)核病的治療。但迫于MDR－TB患者的不斷增多，磺胺類藥物又以抗結(jié)核藥物的形式被推薦［3］，已有研究表明，磺胺類藥物在體內(nèi)外對(duì)于結(jié)核病的治療具有良好的療效［4］。

本研究的目的是評(píng)價(jià)TMP和SMX的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的體外抑菌作用。同時(shí)因抗結(jié)核治療是一個(gè)聯(lián)合化療的過程，也因此對(duì)TMP和（或）SMX與其他抗結(jié)核藥物如R、H、乙胺丁醇（E）、S、卡那霉素（Km）、氧氟沙星（Ofx）、利福布?。≧fb）的體外協(xié)同作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

材料和方法

一、材料

1．菌株來源：H37Rv（ATCC 27294）和120株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室，菌株收集時(shí)間為2010年9月至2010年11月。納入的121株結(jié)核分枝桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是由絕對(duì)濃度法（羅氏含藥培養(yǎng)基）藥敏試驗(yàn)確定，包括MDR菌株32株，非MDR耐藥菌株36株，敏感株53株。

2．試 劑 和 藥 品：SMX（S7507，10g）、TMP（T7883，5g）、R（R3501，5g）、H（I3377，50g）、S（S6501，25g）、E（E4630，25g）、Km（K400，5g）、Ofx（O8757，10g）、Rfb（R3530，25mg）均購自美國Sigma公司；96微孔板（Corning，美國）；Alamar blue（Serotec，英國）；7H9（Difco，美國）；OADC（BD，美國）；Tween－80、二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）和氫氧化鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為化學(xué)分析純。

二、方法

1．微孔板 Alamar blue法（microplate alamar blue assay，MABA）：具體的操作步驟參見參考文獻(xiàn)［5］。藥物的終濃度分別為：SMX 為（0．63～160）μg／ml；TMP為（0．125～32）μg／ml；“TMP∶SMX＝1∶5”為（0．13／0．63～16／80）μg／ml；“TMP∶SMX＝1∶19”為（0．031／0．6～4／76）μg／ml；R為（0．0625～8）μg／ml；H 為（0．0125～1．6）μg／ml；S為（0．125～16）μg／ml；E 為 （0．3125～40）μg／ml；Km 為（0．3125～40）μg／ml；Ofx 為（0．125～16）μg／ml；Rfb為（0．03125～4）μg／ml，SMX、TMP、R、Rfb用DMF溶解，H、S、E、Km用水溶解，Ofx用1%氫氧化鈉溶解，上述藥物濃度均由最高濃度進(jìn)行2倍稀釋，每種藥物包括8個(gè)梯度濃度，每種藥物濃度重復(fù)2孔。選取羅氏培養(yǎng)基上生長2～3周的新鮮菌落，用玻璃珠磨菌，稀釋至1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛龋跰cFarland 1，相當(dāng)于（3～6）×107CFU／ml］，再以1∶25稀釋后向微孔板加入100μl菌液，菌液的終濃度約為106CFU／ml。每個(gè)菌株設(shè)1個(gè)不含藥物的生長對(duì)照孔（陽性對(duì)照）和只含有7H9不含藥物和菌液的無菌對(duì)照孔（陰性對(duì)照），各菌株平行進(jìn)行2次測試。96孔板于37℃孵育5d后在生長對(duì)照孔加入20μl Alamar blue和50μl Tween－80（5．00%）的混合液，37℃孵育24h，如果顏色從藍(lán)色變?yōu)榉凵?，則在各實(shí)驗(yàn)藥物孔內(nèi)加入上述量的 Alamar blue和Tween－80混合液，37℃孵育24h記錄各孔的顏色，藍(lán)色孔為無生長，粉紅色孔為有生長。如出現(xiàn)紫紅色孔，則繼續(xù)在37℃培養(yǎng)24h，如果不變?yōu)榉奂t色且其相連的藍(lán)色孔仍為藍(lán)色，則記錄為有生長。MIC定義為阻止顏色變化 （從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色）的最低藥物濃度。

2．藥物聯(lián)合作用：選取18株臨床分離株（5株MDR，13株非 MDR）和 H37Rv（ATCC 27294）（18株選擇為分層整群抽樣設(shè)計(jì)，即先按照MDR菌株和非MDR菌株進(jìn)行分層，總體MDR菌株∶非MDR菌株＝32∶89，本次抽樣的總數(shù)為18例，按照32∶89比例約為5株MDR菌株，13株非MDR菌株）進(jìn)行藥物相互作用試驗(yàn)。SMX與R、H、E、S、Km、Ofx、Rfb聯(lián)合用藥的 MIC通過 MABA法測定，每個(gè)菌株平行做2次測試。聯(lián)合用藥中每種抗結(jié)核藥的濃度范圍是1／32到4×MIC（9個(gè)濃度，每個(gè)濃度間的梯度值是2倍）。采用分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）來計(jì)算藥物間的相互作用。FICI＝MIC甲藥聯(lián)用／MIC甲藥單用＋MIC乙藥聯(lián)用／MIC乙藥單用［6－7］。FICI≤0．5，協(xié)同作用；0．5＜FICI＜1，加合作用；1≤FICI＜4，無關(guān)作用；FICI≥4，拮抗作用［6］。臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦慢生長分枝桿菌對(duì)于TMP聯(lián)合SMX的MIC≤1／19μg／ml為敏感菌株。質(zhì)控方法同MABA法。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MDR菌株、非MDR菌株、敏感菌株間MIC的比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TMP和SMX的體外抑菌活性

1．不同耐藥類型結(jié)核分枝桿菌SMX、TMP、TMP聯(lián)合SMX的MIC：TMP對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌效果較差，117 株菌株 （117／121，96．70%）的 MIC＞32μg／ml（包括 H37Rv），另外4株菌株的 MIC分別為8μg／ml、8μg／ml、16μg／ml、16μg／ml。TMP和SMX對(duì)121株不同耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌的MIC具體見表1。

2．不同耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”的 MIC分布：SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”對(duì)于敏感菌株組（53株）、MDR菌株組（32株）和非MDR耐藥菌株組（36株）的MIC分布如表2所示。107株（107／121，88．43%）可以被20 μg／ml 的 SMX 抑 制 生 長，109 株 （109／121，90．08%）可以被“5μg／ml TMP＋20μg／ml SMX”抑制生長。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌，TMP和SMX聯(lián)合應(yīng)用未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)（單用TMP殺菌時(shí)絕大部分 MIC＞32μg／ml，TMP、SMX聯(lián)合用藥和單獨(dú)使用SMX的MIC基本一致，故認(rèn)為TMP和SMX在殺傷結(jié)核分枝桿菌上無協(xié)同作用）。單獨(dú)使用SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”的MIC分布對(duì)于121株結(jié)核分枝桿菌的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（成組設(shè)計(jì)秩和檢驗(yàn)Z＝－0．3，P＝0．764）。

表1 不同耐藥類型結(jié)核分枝桿菌的SMX、TMP、TMP聯(lián)合SMX體外抑菌活性

表2 不同耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌SMX和“TMP∶SMX＝1∶5”的MIC分布（株）

3．121株結(jié)核分枝桿菌“TMP∶SMX＝1∶19”的MIC分布：“TMP∶SMX＝1∶19”對(duì)于敏感菌株、MDR菌株和非MDR耐藥菌株的MIC分布如圖1所示，3組“TMP∶SMX＝1∶19”對(duì)不同耐藥類型菌株的 MIC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．111，P＝0．946）。3組菌株的“TMP∶SMX＝1∶19”的MIC 主 要集中在 “0．5μg／ml TMP＋9．5μg／ml SMX”和“1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”，在敏感菌株、MDR菌株和非MDR耐藥菌株中分別占86．79% （46／53）、75．00% （24／32）和 86．11%（31／36）。納入的 121 株 菌株 中，109（109／121，90．08%）株 可 以 被 “1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”抑制生長，5株的 MIC為“2μg／ml TMP＋38μg／ml SMX”，僅有7株的 MIC≥“2μg／ml TMP＋38μg／ml SMX”，包括敏感株5株，MDR菌株2株。

圖1 121株結(jié)核分枝桿菌對(duì)“TMP∶SMX＝1∶19”的MIC分布圖

4．SMX與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用的MIC：SMX與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用對(duì)H37Rv和18株臨床分離株的抑制作用見表3和表4。對(duì)于H37Rv，SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥后，除了Rfb表現(xiàn)出協(xié)同作用，其余藥物均表現(xiàn)為無關(guān)作用。對(duì)18株臨床分離株，SMX 與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥后，14（14／18，77．78%）表現(xiàn)為與Rfb協(xié)同。1株表現(xiàn)為與Ofx協(xié)同，其余藥物聯(lián)合作用的效果主要表現(xiàn)為無關(guān)。

表3 SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)用對(duì)H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的作用

表4 SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)用對(duì)18株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的作用

討 論

我國2008年耐藥基線調(diào)查數(shù)據(jù)表明，目前常規(guī)抗結(jié)核藥物耐藥形式非常嚴(yán)峻，對(duì)于一線抗結(jié)核藥物H、R、E和S，初治患者的耐藥率分別為16%、6．7%、4．9%和27．7%，而對(duì)于復(fù)治患者則分別上升至38．5%、29．4%、17．2%和37．2%［8］，急需發(fā)現(xiàn)新的抗結(jié)核分枝桿菌藥物或是開發(fā)傳統(tǒng)藥物的抗結(jié)核效果。一系列的研究均表明磺胺類藥物具有潛在的抗結(jié)核療效。2009年，一篇關(guān)于單獨(dú)應(yīng)用SMX治療MDR－TB患者顯效的報(bào)道引起了對(duì)磺胺類藥物治療結(jié)核病的關(guān)注［4］。同時(shí)該研究也表明在44株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中有98%可以被“1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”抑 制 生 長。Huang等［9］研究表明納入的117株結(jié)核分枝桿菌中80%可以被“1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”抑制。本研究的數(shù)據(jù)與上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本一致，但鑒于各國流行菌株耐藥情況的差異，以及測定MIC時(shí)采用培養(yǎng)基的不同（7H10、7H11和7H9），以致敏感度的數(shù)據(jù)還存在一定的差異。

磺胺類藥物問世已經(jīng)有50余年歷史，由于其價(jià)格低廉且無明顯的不良反應(yīng)而在臨床廣泛應(yīng)用。對(duì)流感嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌也有較好的抑菌效果，García－Cobos等［10］研究表明109株流感嗜血桿菌有38%對(duì)TMP聯(lián)合SMX耐藥，耐藥臨界值為MIC≥4μg／ml，MIC范圍為≤0．25～32μg／ml。對(duì)于金黃色葡萄球菌，耐藥臨界值為1．6μg／ml，4210份菌株中有81（81／4210，1．92%）株對(duì) TMP聯(lián)合SMX 耐 藥，MIC 范 圍 為 0．25～16．00μg／ml，97．5%的菌株 MIC集中在0．25μg／ml［11］。本研究表明TMP聯(lián)合SMX對(duì)于結(jié)核分枝桿菌也有較好的抑菌作用，CLSI推薦慢生長分枝桿菌對(duì)于TMP＋SMX復(fù)方制劑的 MIC以≤（1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX）為敏感菌株。按照此判定標(biāo)準(zhǔn)，109株（109／121，90．08%）對(duì) TMP＋SMX復(fù)方制劑敏感。并且TMP＋SMX復(fù)方制劑對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的抑菌效果與細(xì)菌本身的耐藥類型不相關(guān)，MIC在MDR組（32株）、敏感組（53株）和非 MDR耐藥組（36株）之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．111，P＝0．946）。

結(jié)核病的治療以化療為核心，聯(lián)合用藥為化療的基本原則，目的是利用多種抗結(jié)核藥物的交叉殺菌作用，提高殺菌、抑菌的能力，保證療效和防止產(chǎn)生耐藥性［12］。本次研究結(jié)果表明，TMP在體外對(duì)結(jié)核分枝桿菌抑菌效果很差，在藥物濃度為32μg／ml時(shí)，對(duì)于96．70%（117／121）的細(xì)菌依然沒有抑菌效果。因此，本研究僅對(duì)SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。在18株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，有14株（14／18，77．78%）表現(xiàn)出 SMX與Rfb之間有協(xié)同性。對(duì)于H37Rv，SMX與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合用藥后，除Rfb表現(xiàn)出協(xié)同作用外，其他藥物均表現(xiàn)為無關(guān)。

本研究證實(shí)納入研究的121株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株有 90．08%（109／121）可以被 “1μg／ml TMP＋19μg／ml SMX”劑量的復(fù)方制劑所抑制。Vilchèze等［13］研究表明，口服“960mg TMP＋4．8g SMX”劑量的復(fù)方制劑之后，TMP的血藥濃度可以達(dá)到4．4μg／ml，SMX 的血藥濃度可以達(dá)到81．5 μg／ml。Alsaad等［14］研究表明，10例采用復(fù)方新諾明進(jìn)行抗結(jié)核治療的MDR－TB患者，口服480mg的復(fù)方新諾明后，平均的fAUC0－24／MIC比值為10．8。因此，從理論上講SMX可以抑制體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生長，也非常有希望成為潛在的抗結(jié)核治療藥物，但需要更多的體內(nèi)和體外試驗(yàn)對(duì)其抗結(jié)核療效進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

本研究雖然對(duì)磺胺類藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌作用進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和評(píng)價(jià)，但由于試驗(yàn)技術(shù)所限，仍存在以下不足：（1）雖然國內(nèi)外研究均有使用MABA法檢測抗生素對(duì)結(jié)核分枝桿菌MIC的報(bào)道［15－18］，且該法對(duì)于 H和R的 MIC檢測結(jié)果可靠［15］，但對(duì)于TMP和（或）SMX檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性尚無定論。（2）MABA法作為初步檢測TMP和（或）SMX對(duì)于Mtb的MIC的方法結(jié)果比較可靠，但要慎重判讀處于耐藥臨界值附近的MIC值。

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