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    肺結(jié)核患者療程中外周血輔助性和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)研究

    2013-09-02 07:28:54張影陸堅(jiān)侯志平張明霞陳心春張興樹邱振綱
    中國防癆雜志 2013年6期
    關(guān)鍵詞:調(diào)節(jié)性抗結(jié)核結(jié)核

    張影 陸堅(jiān) 侯志平 張明霞 陳心春 張興樹 邱振綱

    近年來,關(guān)于各種免疫細(xì)胞與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的研究越來越多,而目前研究較多的是CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞17(helper T cells 17,Th17)。CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的抑制自身免疫和移植排斥反應(yīng)作用的一群細(xì)胞,約占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%~10%,在免疫調(diào)節(jié)過程中主要發(fā)揮抑制作用[1-6]。Th17細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞亞群,其通過分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17A和IL-17F而發(fā)揮重要的促炎癥作用[7-12]。目前,其與結(jié)核病之間關(guān)系的研究已成為近年的熱點(diǎn),有研究顯示,Th17細(xì)胞是IL-17的主要來源細(xì)胞,而且參與抗結(jié)核的保護(hù)性免疫反應(yīng)過程[13-16]。CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞作為兩組在結(jié)核性免疫過程中發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞,各自在結(jié)核免疫反應(yīng)中作用的研究均較多,但對(duì)于兩組細(xì)胞在抗結(jié)核治療過程中的相互作用及其相應(yīng)動(dòng)態(tài)變化的研究報(bào)道較少。為此,筆者就抗結(jié)核治療中兩組細(xì)胞的相互變化情況進(jìn)行了研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

    材料和方法

    一、患者來源和標(biāo)本

    分為肺結(jié)核患者組,健康對(duì)照組和結(jié)核潛伏感染組共3個(gè)組。肺結(jié)核患者組32例,均為來自深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院2011年1月至2011年6月門診收治的痰抗酸桿菌(acid-fast bacilli,AFB)涂片陽性的新發(fā)肺結(jié)核患者,其中男20例,女12例,年齡16~59歲,平均年齡(33.5±10.3)歲,隨訪抗結(jié)核治療后3個(gè)月、6個(gè)月;所有肺結(jié)核患者均經(jīng)臨床癥狀、體征、X線胸片、痰抗酸桿菌涂片、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果確定,并且菌種鑒定均為結(jié)核分枝桿菌。門診收治患者一旦發(fā)現(xiàn)痰涂片結(jié)果顯示陽性,且無涉及排除標(biāo)準(zhǔn)中任何一條,即考慮入組,待患者痰分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果明確為結(jié)核分枝桿菌感染,即算是完全符合條件入組,如痰分枝桿菌培養(yǎng)陰性,或不是結(jié)核分枝桿菌感染則排除。

    對(duì)照組包括健康對(duì)照組和結(jié)核潛伏感染組。納入標(biāo)準(zhǔn)為:健康對(duì)照組45例,男25例,女20例,年齡20~49歲,平均年齡(35.5±10.1)歲,健康對(duì)照組為廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳第三醫(yī)院2011年1月至2011年3月體檢科健康體檢者,所有健康者均無咳嗽、咯痰、發(fā)熱等相關(guān)癥狀,X線胸片無異常,經(jīng)我院自行研制結(jié)核酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)提示結(jié)核分枝桿菌陰性;結(jié)核潛伏感染組25例,男13例,女12例,年齡25~52歲,平均年齡(36.2±9.9)歲。結(jié)核潛伏感染者為廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳第三醫(yī)院2011年1月至2011年3月體檢科健康體檢者,所有潛伏感染者均無咳嗽、咯痰、發(fā)熱等相關(guān)癥狀,X線胸片無異常,但經(jīng)我院自行研制的結(jié)核酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)提示結(jié)核分枝桿菌陽性。

    所有研究對(duì)象均排除乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HIV等病毒感染;排除其他慢性疾病如糖尿病、高血壓、腎炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾??;所有結(jié)核病患者在入組前均未接受過抗結(jié)核治療。所有研究對(duì)象均采集肝素鋰抗凝的靜脈血5ml。具體程序經(jīng)深圳第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,患者及志愿者均簽署知情同意書。

    本實(shí)驗(yàn)在入組結(jié)束后已對(duì)三組入組者的性別進(jìn)行卡方檢驗(yàn)、年齡進(jìn)行方差分析,提示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

    二、檢測(cè)方法

    (一)主要設(shè)備和試劑

    1.設(shè)備:流式細(xì)胞儀為美國BD公司生產(chǎn),型號(hào)為BD Canto流式細(xì)胞儀。CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋電機(jī)公司。

    2.試劑:單克隆抗體 CD3-PerCP-Cy5.5(產(chǎn)品編號(hào)555334)、CD4-PerCP-Cy5.5(產(chǎn)品編號(hào)555348)、CD25-FITC(產(chǎn)品編號(hào)347643)、CD127-APC(產(chǎn)品編號(hào)558598)均購自美國BD公司。單克隆抗體CD3-APC-Cy7(產(chǎn)品編號(hào) 344818)、CD8-APC-Cy7(產(chǎn)品編號(hào)301016)、IL-17-PE(產(chǎn)品編號(hào)512306)均購自美國BioLegend公司。RPMI 1640培養(yǎng)基[含100mg/L鏈霉素、1×105U/L盤尼西林、10%胎牛血清(澳大利亞Invitrogen公司)、5×10-5mol/L 2-巰基乙醇]購自美國GIBCO公司。刺激物佛波酯(propylene glycol monomethyl ether acetate,PMA)、離子霉素(ionomycin)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(brefeldin A,BFA)均購自美國 Sigma-Aldrich公司。溶 血 素 (FACS lysing solution)及 破 膜 劑(FACS permeabilizing solution)均購自 BD Biosciences公司。密度梯度分離液LymphoprepTM1.077購自挪威Axis-Shield公司。

    表1 三組入組者的性別年齡的比較

    (二)流式細(xì)胞術(shù)分析

    1.Th17細(xì)胞檢測(cè):分別取45名健康志愿者、25例潛伏感染者肝素鋰抗凝全血250μl,32例活動(dòng)性肺結(jié)核患者治療前及其治療3個(gè)月、6個(gè)月肝素鋰抗凝全血250μl,與750μl含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基充分混勻,共1ml,此培養(yǎng)體系中加入刺激物PMA、離子霉素終濃度分別為(50ng/ml、1μg/ml),振蕩混勻后于CO2培養(yǎng)箱,37℃孵育。1h后,在培養(yǎng)體系中加入阻斷因子BFA(終濃度10μg/ml),繼續(xù)CO2培養(yǎng)箱37℃孵育5h。常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞表面 CD3-PerCP-Cy5.5、CD8-APC-Cy7、溶血素、破膜劑、細(xì)胞內(nèi)IL-17-PE因子染色(IL-17為Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子,因此檢測(cè)IL-17分泌量即可反映Th17細(xì)胞量)。具體操作均參照各抗體說明書執(zhí)行。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色結(jié)果分析。在淋巴細(xì)胞設(shè)門分析CD3+CD8-細(xì)胞(即CD3+CD4+細(xì)胞)表達(dá)情況,然后在CD3+CD4+細(xì)胞設(shè)門分析IL-17細(xì)胞因子所占CD3+CD4+T細(xì)胞的百分率(圖1)。

    2.CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè):分別取45名健康志愿者、25例潛伏感染者肝素鋰抗凝血4ml,32例活動(dòng)性肺結(jié)核患者治療前及其治療3個(gè)月、6個(gè)月肝素鋰抗凝血4ml,使用LymphoprepTM1.077密度梯度分離液經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),取2×105個(gè)單個(gè)核細(xì)胞,加入 APC-Cy7 標(biāo)記的 CD3、PerCPCy5.5標(biāo)記的CD4、FITC標(biāo)記的CD25、APC標(biāo)記的CD127抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色,具體操作均參照各抗體說明書執(zhí)行。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色結(jié)果分析。在淋巴細(xì)胞設(shè)門分析CD3、CD4細(xì)胞表達(dá)情況,然后在CD4細(xì)胞設(shè)門分析CD25+CD127low細(xì)胞所占CD3+CD4+T細(xì)胞的百分率(圖2)。

    (三)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    結(jié) 果

    圖1 肺結(jié)核患者外周血IL-17表達(dá)散點(diǎn)圖

    圖2 肺結(jié)核患者外周血CD4+CD25+CD127low T細(xì)胞表達(dá)散點(diǎn)圖

    1.肺結(jié)核患者組外周血IL-17表達(dá)情況:肺結(jié)核患者組非特異性IL-17表達(dá)為(3.25±1.68)%,較健康對(duì)照組[(4.62±1.46)%]明顯較低(F=6.633,P<0.0001),與 潛 伏 感 染 者 [(4.12±1.82)%]比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺結(jié)核患者隨治療時(shí)間的延長,IL-17逐漸增加,治療6個(gè)月[(5.58±1.66)%]較治療前[(3.25±1.68)%]及治療3個(gè)月[(4.17±2.27)%]明顯增加(F=12.244,P<0.0001和P=0.004)。治療3個(gè)月與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.244,P=0.057),治療6個(gè)月高于健康對(duì)照組(t=2.671,P=0.0093)(表2,3)。

    表2 治療前各組外周血IL-17及CD4+CD25+CD127low T細(xì)胞表達(dá)情況

    表3 肺結(jié)核患者組療程中外周血IL-17及CD4+CD25+CD127low T細(xì)胞表達(dá)情況

    2.肺結(jié)核患者組外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)情況:肺結(jié)核患者組外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)為(6.59±1.73)%,較健康對(duì)照組[(4.97±1.60)%]及結(jié)核潛伏感染組[(5.00±1.08)%]明顯偏高(F=11.986,P值均<0.0001)。健康對(duì)照組與結(jié)核潛伏感染組的比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.986,P=0.937)。肺結(jié)核患者組抗結(jié)核治療3個(gè)月CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平為(8.28±2.04)%,較治療前(6.59±1.73)%明顯增加(F=6.458,P=0.001);治療6個(gè)月CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為(7.46±1.87)%,與治療前及治療3個(gè)月比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.458,P=0.068和P=0.085),但仍較健康對(duì)照組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.255,P<0.0001)(表2,4)。

    表4 各組治療6個(gè)月外周血IL-17及CD4+CD25+CD127low T細(xì)胞表達(dá)情況

    討 論

    Th17在結(jié)核感染中發(fā)揮的保護(hù)性細(xì)胞免疫不容忽視。Th17細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞亞群,但是不同于Th1和Th2細(xì)胞群。Th17細(xì)胞通過產(chǎn)生的IL-17與靶細(xì)胞的IL-17受體(IL-17R)結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的功能,可以有效地介導(dǎo)病變組織的炎癥反應(yīng)[17-19]。研究表明,人體感染結(jié)核分枝桿菌后可以誘導(dǎo)抗原特異性Th17細(xì)胞反應(yīng),并發(fā)現(xiàn)與單純結(jié)核分枝桿菌暴露者相比,活動(dòng)性肺結(jié)核患者體內(nèi)Th17細(xì)胞減少。并有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌非特異性Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)也被抑制,而且Th17細(xì)胞減少的數(shù)量與結(jié)核感染嚴(yán)重程度呈正比[17]。

    同樣,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在結(jié)核免疫中的作用也很重要。研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過上調(diào)表達(dá)FoxP3(forkhead box P3)來發(fā)揮免疫抑制功能[20],但是FoxP3的檢測(cè)操作復(fù)雜,需要破細(xì)胞核核膜操作,不宜常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞功能的研究[21]。另有研究表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中低表達(dá)CD127,CD4+CD25+CD127low被認(rèn)為是一種更為理想的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子標(biāo)志[22]。機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫主要是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不僅與結(jié)核分枝桿菌感染的數(shù)量和毒力有關(guān),與宿主的細(xì)胞免疫功能也有著密切的關(guān)系。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能顯著抑制PBMC和CD4+CD25-T細(xì)胞對(duì)BCG的增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子的分泌[20],其通過抑制Th1細(xì)胞免疫反應(yīng),導(dǎo)致Th1細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2分泌的減少,削弱機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除能力,使結(jié)核分枝桿菌感染慢性化。同時(shí)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也可抑制過強(qiáng)的Th1細(xì)胞免疫反應(yīng),從而避免機(jī)體的免疫病理損害[23]。

    本研究通過對(duì)45名健康對(duì)照者、25例結(jié)核潛伏感染者、32例肺結(jié)核患者及其結(jié)核治療隨訪過程的外周血標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn),肺結(jié)核患者組外周血非特異性Th17細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)較健康對(duì)照組及結(jié)核潛伏感染組明顯降低,說明結(jié)核分枝桿菌感染后,機(jī)體Th17細(xì)胞應(yīng)答明顯受到抑制,不能產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)。經(jīng)治療后,結(jié)核病患者外周血IL-17明顯升高,并較健康對(duì)照組高。32例肺結(jié)核患者治療3個(gè)月抗酸染色涂片及痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均陰性,治療6個(gè)月X線胸片結(jié)核病灶均表現(xiàn)為明顯吸收,其中3例患者胸部X線片表現(xiàn)為完全吸收,IL-17的表達(dá)與32例患者臨床轉(zhuǎn)歸表現(xiàn)出良好地一致性(因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)沒有做患者轉(zhuǎn)歸的CT評(píng)分,僅僅用X胸片及痰抗酸染色涂片及痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果來表達(dá)轉(zhuǎn)歸情況,所以就沒有在結(jié)果中用表格再次表達(dá)出來,僅在此處提及)。

    本研究中,肺結(jié)核患者組CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組及結(jié)核潛伏感染組,雖然CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在治療3個(gè)月仍有進(jìn)一步升高,可能由于短期抗結(jié)核治療后大量結(jié)核分枝桿菌釋放而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生免疫抑制現(xiàn)象,但隨著有效的抗結(jié)核治療的進(jìn)行,機(jī)體免疫系統(tǒng)功能逐漸恢復(fù),6個(gè)月后,CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較治療3個(gè)月呈下降趨勢(shì),雖然尚未下降至健康者水平,但通過對(duì)本研究入組結(jié)核病患者CD3、CD4、CD8細(xì)胞的隨訪發(fā)現(xiàn),雖然結(jié)核病患者治療過程中CD3、CD4、CD8陽性細(xì)胞均有不同程度升高,但并未升至正常水平。CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過上調(diào)表達(dá)FoxP3來發(fā)揮免疫抑制功能,而Th17細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子IL-17A和IL-17F而發(fā)揮顯著促炎癥作用。關(guān)于Th17抑制與CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的關(guān)系,目前認(rèn)為兩者互為拮抗,在Th17及CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化過程均要通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),另 外 CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3通過直接與視黃酸相關(guān)的孤兒核受體(retinoic acid-related orphan receptor gamma t,RORγt)結(jié)合而抑制RORγt介導(dǎo) IL-17AmRNA 的轉(zhuǎn)錄,從 而 影 響Th17細(xì)胞的功能[24]。筆者也通過隨訪也發(fā)現(xiàn)增高的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17抑制相一致,符合目前文獻(xiàn)報(bào)道。

    綜上所述,抗結(jié)核治療過程中Th17的升高伴CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞下降,說明兩者在結(jié)核免疫中均發(fā)揮重要作用,提示兩者可作為今后抗結(jié)核治療療效考核的依據(jù)。

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