磁共振波譜成像觀察大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞的針刺治療效果

李歡歡 黃丙倉， 許曉嵐 武剛

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院放射科，上海 201700，2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，上海 200135)

本研究應(yīng)用氫質(zhì)子磁共振波譜(1H-magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)觀察大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型經(jīng)針刺治療后病灶局部腦代謝物的變化規(guī)律，以探討1H-MRS在評(píng)價(jià)針刺治療腦缺血疾病中的實(shí)用價(jià)值［1］。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 手術(shù)器械:眼科剪、顯微剪、彎剪、眼科彎鑷、直鑷、止血鉗、玻璃分針、動(dòng)脈夾、大鼠解剖臺(tái)及固定繩、自制拉鉤、圓針、三角針、手術(shù)用0號(hào)及4號(hào)線、華佗牌1.5寸毫針。MCAO栓線(直徑為0.26 mm)購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司。碘附消毒液、10%水合氯醛、青霉素溶液為本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 研究方法

1.2.1 MCAO模型的構(gòu)建 健康雄性SD大鼠60只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):0946490)。標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由進(jìn)水，飼養(yǎng)至體質(zhì)量250～300 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為模型組(n=27)、針刺組(n=27)和假手術(shù)組(n=6);再按照磁共振成像(MRI)檢查時(shí)段將模型組和針刺組分為3個(gè)亞組:24 h、3 d、7 d，每個(gè)亞組9只。MCAO模型構(gòu)建:首先，10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠，待大鼠處于麻醉狀態(tài)時(shí)，將其仰臥位固定于解剖臺(tái)上，剪去頸部鼠毛，碘附消毒。取頸部正中線作約2 cm的縱行切口，上至下頜骨平面，下至胸骨柄上緣，玻璃分針分離右側(cè)頸前肌群，顯露右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)，并將其與伴行的迷走神經(jīng)分離，在頸CCA下方穿線備用，提拉穿線向上分離右側(cè)頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)、右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，在 ICA分叉處將 ECA結(jié)扎，并在ICA遠(yuǎn)心端下方穿線備用，用兩把止血鉗提拉備用線兩端，交錯(cuò)放置，暫時(shí)夾閉ICA，用顯微剪在距CCA分叉部4 mm處斜行剪一小切口，用眼科鑷順勢(shì)將備好的栓線經(jīng)切口插入，當(dāng)栓線標(biāo)記接近ECA和ICA分叉處插入深度約18 mm時(shí)，緩慢推線遇阻力停止，將CCA下方的備用線與栓線近心端一并結(jié)扎，剪斷各結(jié)扎線殘端，縫合皮膚，切口處滴青霉素溶液2～3滴，腹腔注射2 mL 0.9%氯化鈉液，然后將大鼠放回籠中。假手術(shù)組手術(shù)操作步驟基本同上，只結(jié)扎右側(cè)CCA及ECA，不插入線栓。

1.2.2 MRI參數(shù)及后處理方法 采用Philips Intera Achieva 1.5T超導(dǎo)MR成像系統(tǒng)，并用EWS影像后處理工作站處理圖像，4通道大鼠專用線圈。大鼠麻醉后俯臥位，頭置于線圈中央，毛巾覆蓋體表保溫。行常規(guī)橫斷位SE序列T1WI、T2WI掃描，DWI檢查后行 H-MRS。MRS:點(diǎn)分辨自旋回波波譜(point-resolved spectroscopy，PRESS)，刺激回波采集樣式(stimulated echo acquisition mode，STEAM)，采用二維多體素波譜分析序列，在T2橫斷位像上定位，置于大腦中動(dòng)脈供血區(qū)層面(包括梗死區(qū)及其周圍區(qū))，體素容積為3 mm×3 mm×3 mm，掃描前自動(dòng)勻場(chǎng)，采集時(shí)間為8 min。在右側(cè)梗死區(qū)周圍選取5～8 mm2感興趣區(qū)，統(tǒng)計(jì)該區(qū)域的各代謝物波峰下面積。

1.2.3 穴位選取與針刺方法 參照動(dòng)物穴位定位圖譜［2］，選擇大鼠百會(huì)穴、太陽穴。用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)，用1.5寸毫針頭穴透刺法(百會(huì)透太陽)行針刺，留針30 min，留針期間每隔10 min提插捻轉(zhuǎn)行針1 min，每隔24 h針刺一次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布采用兩樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn);兩組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCAO模型的建立及大鼠偏癱癥狀的變化本研究中建立的大鼠MCAO模型左肢均有不同程度的活動(dòng)障礙。模型組死亡4只，術(shù)中死亡1只，24 h內(nèi)死亡1只，3 d內(nèi)死亡2只;針刺組死亡3只，24 h內(nèi)死亡1只，3 d內(nèi)死亡2只;死亡大鼠24 h MRI檢查均見梗死區(qū)面積較大。死亡大鼠相應(yīng)時(shí)段數(shù)據(jù)缺失，其余大鼠可見肢體活動(dòng)狀況隨時(shí)間延長(zhǎng)和針刺治療得到相應(yīng)的改善。

2.2 常規(guī)T2WI表現(xiàn) T2WI及對(duì)應(yīng)MRS成像結(jié)果見圖1。T2WI示，模型組24 h亞組和針刺組24 h亞組大鼠的右側(cè)基底節(jié)及額頂葉皮質(zhì)區(qū)信號(hào)較對(duì)側(cè)鏡像區(qū)明顯增高，局部腦溝回變淺呈現(xiàn)腦腫脹的改變;模型組3 d亞組栓塞區(qū)T2WI信號(hào)與24 h亞組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;針刺組3 d亞組栓塞區(qū)T2WI信號(hào)與24 h亞組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩亞組在造模7 d后栓塞區(qū)T2WI高信號(hào)范圍較24 h亞組和3 d亞組有縮小趨勢(shì)，假手術(shù)組T2WI未見明顯異常信號(hào)。

2.31H-MRS 檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 假手術(shù)組 假手術(shù)組腦組織MRS波形同正常腦組織磁共振波譜曲線，N-乙酰天門冬氨酸(N-acetyl aspartate，NAA)峰最為明顯;肌酸(creatine，Cr)、膽堿復(fù)合物(choline，Cho)峰曲線下面積相近;乳酸(lactate，Lac)峰大部分未見，小部分為倒置雙峰，波峰下面積明顯低于NAA、Cr、Cho。兩側(cè)相應(yīng)部位腦組織代謝物無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 造模后各組常規(guī)T2WI表現(xiàn)及MRS成像

2.3.2 模型組及針刺組1H-MRS檢測(cè)結(jié)果 模型組和針刺組的24 h亞組、3 d亞組均見梗死周圍區(qū)NAA濃度持續(xù)下降，7 d亞組NAA濃度有所上升;模型組24 h亞組和針刺組24 h亞組NAA濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.5);針刺組3 d亞組和針刺組7 d亞組NAA濃度較模型組明顯升高(31.43±2.88比 25.90 ±3.48，60.84 ±2.76 比 54.31 ±1.40;均 P＜0.05)。模型組和針刺組的24 h亞組的Lac濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);針刺組3 d亞組和針刺組7 d亞組Lac濃度較模型組明顯降低(58.82±3.78 比 65.15 ±3.58，50.22 ±4.33比 55.46 ±4.06;均 P ＜0.05)，見圖 2、表1。Cho、Cr濃度隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)有不同程度升高，但模型組與針刺組各時(shí)段亞組濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

圖2 模型組與針刺組各時(shí)段亞組NAA與Lac濃度的變化

表1 模型組及針刺組各時(shí)段亞組NAA和Lac濃度比較()

表1 模型組及針刺組各時(shí)段亞組NAA和Lac濃度比較()

?

表2 模型組及針刺組各時(shí)段Cho和Cr濃度比較()

表2 模型組及針刺組各時(shí)段Cho和Cr濃度比較()

?

3 討 論

MRS是利用磁共振現(xiàn)象和化學(xué)位移原理對(duì)特定原子核及其化合物進(jìn)行分析的無損傷性研究活體組織生化代謝的一種技術(shù)。不同化合物中相同原子的進(jìn)動(dòng)頻率不同，故可在MRS頻率軸的不同位置形成不同的代謝峰，其峰下面積反映不同化合物濃度，可用積分法進(jìn)行定量分析。近年來對(duì)1H-MRS研究顯示［3］，1H-MRS可檢測(cè)的腦組織的代謝產(chǎn)物主要有 NAA、Lac、Cho和 Cr。NAA 在約2.0 ppm 時(shí)發(fā)生共振，可以作為反映神經(jīng)元功能狀況的內(nèi)標(biāo)物，NAA降低提示神經(jīng)元和突觸的損失及功能異常。Lac在約1.33 ppm處呈倒置雙峰，它為糖酵解的最終代謝產(chǎn)物，可反映無氧酵解的情況，正常腦組織磁共振波譜中一般不會(huì)有Lac峰。當(dāng)腦缺血、氧供減少、無氧酵解率增加時(shí)，Lac含量亦增加［4］。Cho峰出現(xiàn)于約3.2 ppm處，可反映腦內(nèi)總膽堿的儲(chǔ)藏量，其含量增加可能是細(xì)胞合成或分泌量增加的反映。Cr峰見于約3.03 ppm處，是能量代謝的一種產(chǎn)物，通常將Cr作為參照波峰，進(jìn)行半定量分析。

NAA幾乎僅存在于成熟腦組織的神經(jīng)細(xì)胞中，被認(rèn)為是神經(jīng)病理狀態(tài)的生化標(biāo)志，因腦組織壞死而存活的神經(jīng)元數(shù)量減少會(huì)導(dǎo)致NAA降低，但并不是NAA降低的必然因素，因?yàn)閮H有腦功能失調(diào)而無神經(jīng)元死亡也可引起NAA的顯著丟失［5］。Lac是早期缺血的敏感指標(biāo)，腦缺血早期即可出現(xiàn)Lac峰，Lac峰的出現(xiàn)通常早于NAA峰的下降，但檢測(cè)到Lac并不預(yù)示著一定是梗死，有時(shí)非梗死區(qū)域也可檢測(cè)到少量Lac［6］。本研究證明，模型組和針刺組梗死區(qū)周圍主要代謝產(chǎn)物的總體變化是一致的，均在24 h檢測(cè)到NAA下降、Lac升高，之后NAA在7 d時(shí)回升，Lac在3 d時(shí)逐漸回落，但模型組和針刺組在不同時(shí)間其主要代謝物在量上有差異，3 d和7 d時(shí)針刺組NAA濃度較模型組高，而Lac濃度較模型組低;同時(shí)，大鼠的神經(jīng)功能狀態(tài)也逐漸好轉(zhuǎn)，7 d時(shí)多數(shù)大鼠已無明顯的肢體運(yùn)動(dòng)障礙，而且針刺組的神經(jīng)功能評(píng)分優(yōu)于模型組，證明針刺對(duì)腦梗死的治療作用是通過促進(jìn)梗死灶神經(jīng)元的再生和調(diào)節(jié)局部代謝實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于Cho和Cr，不同研究得到的結(jié)論不同［7］，Gillard 等［8］認(rèn)為，腦梗死一段時(shí)間內(nèi)，膽堿復(fù)合物及肌酸升高，升高的區(qū)域多見于梗死的病灶，反映了細(xì)胞磷脂膜結(jié)構(gòu)和髓鞘的崩解及能量代謝的異常。Saunders等［9］的臨床研究則顯示，膽堿復(fù)合物在梗死28 h內(nèi)變化不明顯。在亞急性期和慢性期膽堿復(fù)合物的濃度升高，且這與梗死灶膠質(zhì)增生、梗死灶部分修復(fù)有關(guān)。本研究中模型組與針刺組Cho、Cr濃度在檢測(cè)的各時(shí)段均較假手術(shù)組有不同程度升高，但模型組與針刺組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明腦梗死后Cho、Cr升高，但針刺的調(diào)節(jié)作用不明顯。假手術(shù)組雙側(cè)NAA、Cho、Cr無明顯變化，部分檢測(cè)到少量Lac，說明一側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的結(jié)扎對(duì)腦缺血代謝物的影響不大，機(jī)體可以通過基底動(dòng)脈環(huán)和其他側(cè)支循環(huán)的生理性代償來改善腦缺血的狀況。

應(yīng)用磁共振波譜成像觀察大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞針刺治療效果時(shí)，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面:(1)線栓法的原理是機(jī)械式阻塞造成局灶性腦缺血，其發(fā)病過程與人群自發(fā)的腦梗死有一定差異;(2)針刺組大鼠行針刺均在其麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，針刺療效必然會(huì)受到麻醉藥物的影響;(3)每次針刺的手法力度不同可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的差異，因此需保證同一人施針，手法力度保持一致;(4)數(shù)據(jù)處理中ROI大小均為手動(dòng)調(diào)節(jié)，故每次測(cè)量存在誤差，ROI的選擇應(yīng)避開骨質(zhì)和血腫等影響磁場(chǎng)均勻性的部位，并盡量減少腦脊液部分容積效應(yīng)影響和灰白質(zhì)之間的差異。

［1］ Warlow C P.Epidemiology of stroke［J］.Lancet，1998，352(3):1-4.

［2］ 林文注，王佩.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)大鼠的常用針灸穴位［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1994:271.

［3］ Sarah JN，Edward G，Andrea P，et al.In vivo molecular imaging for palnning radiation therapy of gliomas:an application of1HMRSI［J］.Journal of Magnetic Resonance Imaging，2006，16(4):464-467.

［4］ Dani KA，An L，Henning EC，et al.Multivoxel MR spectroscopy in acute ischemic stroke comparison to the stroke protocol MRI［J］.Stroke，2012，43(11):2962-2967.

［5］ Demougeot C，Bertrand N，Prigent-Tessier A，et al.Reversible loss of N-Acetyl-Aspartate in rats subjected to long-term focal cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(4):482-489.

［6］ Floor C，Bakker，Catharina JM，et al.Cognitive impairment is related to cerebral lactate in patients with carotid artery occlusion and ipsilateral transient ischemic attacks［J］.Stroke，2003，34(6):1419-1424.

［7］ Mu?oz Maniega S，Cvoro V，Armitage PA，et al.Choline and creatine are not reliable denominators for calculating metabolite ratios in acute ischemic stroke［J］.Stroke，2008，39(9):2467-2469.

［8］ Gillard JH，Barker PB，Van Zijl PCM，et al.Proton MR spectroscopy in acute middle cerebral artery stroke［J］.AJNR，1996，17(5):873-886.

［9］ Saunders DE，Howe FA，Boogaart AD，et al.Continuing ischemic damage after acute middle cerebral artery infarction in humans demonstrated by short-echo proton spectroscopy ［J］.Stroke，1995，26(6):1007-1013.