重組禽流感病毒滅活疫苗（H9N2亞型，Re-9株）對2010年～2011年流行病毒株免疫效力的研究

楊 婧，曾顯營，張盼濤，馮華朋，李倩倩，鄧國華，李雁冰，田國彬，陳化蘭

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室/國家禽流感參考實驗室，黑龍江哈爾濱 150001）

H9亞型禽流感病毒（Avian influeuza virus，AIV）為低致病性病毒，呈世界性分布，一般可分為北美和歐亞兩個種系[1]。我國H9亞型AIV屬于歐亞種系，于1970年首次在香港發(fā)現(xiàn)，1990年左右開始在中國大肆流行[2]。H9亞型AIV除可以造成禽呼吸道疾病外，同時可能造成蛋雞產(chǎn)蛋量下降及肉雞生長緩慢；并常與其它病毒病或細(xì)菌病混合感染，可造成較高的死亡率[3]。近年來，有研究表明一些H9亞型AIV對人源唾液酸受體的親和力逐漸增強，并有報道人類感染的臨床病例，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅[4-6]。因此，對H9亞型禽流感（AI）的研究和防控具有重要的經(jīng)濟和公共衛(wèi)生意義。

疫苗免疫是我國控制H9亞型AI的重要措施之一，我國有不同單位研制或生產(chǎn)的多株H9N2亞型AIV滅活疫苗，并在我國廣泛應(yīng)用。而在活禽市場中依然能夠監(jiān)測到大量的H9N2亞型AIV。為獲得更好的免疫保護效果，本實驗室在分析大量H9N2亞型AIV后，利用成熟的反向遺傳操作技術(shù)，研制出Re-9株病毒，已有試驗結(jié)果表明該疫苗能對2008年的流行病毒株的攻擊提供良好的免疫保護作用[7]。由于AIV易發(fā)生基因重組，因此選擇我國近兩年流行的5株分離株重新評估Re-9株的免疫保護作用。

1 材料和方法

1.1 病毒株 H9N2亞型重組AIV Re-9株由本實驗室構(gòu)建，其親本株為A/Chicken/Hunan/S933/2008（簡稱HuN33）；5株攻毒株分別為：A/Chicken/Chongqing/S1258/2011（簡 稱 CQ58）、 A/Chicken/Liaoning/S3037/2010（簡稱 LN37）、A/Chicken/Guangxi/S1435/2010（簡稱 GX35）、A/Chicken/Fujian/S1239/2010（簡稱 FJ39）、A/Duck/Hubei/S1146/2011（簡稱HuB46），均由本實驗室分離、鑒定和保存。

1.2 SPF雞胚和SPF雞 9日齡～11日齡SPF雞胚和4周齡的SPF雞均由本所實驗動物中心提供；動物飼養(yǎng)和感染實驗均在負(fù)壓隔離器中進行。

1.3 疫苗的制備 按照現(xiàn)有H9N2亞型AIV滅活疫苗規(guī)程，以Re-9株為毒種制備滅活疫苗。

1.4 HA基因和NA基因的同源性分析 對疫苗株Re-9與親本株HuN33和2010年～2011年分離的5個代表株CQ58、LN37、GX35、FJ39、HuB46進行HA基因和NA基因的測序，用Megalign進行同源率分析。

1.5 病毒株的雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定 將CQ58、LN37、GX35、FJ39、HuB46 5 個分離株分別用無菌PBS作10倍倍比稀釋，取10-5～10-106個稀釋度，每個稀釋度以尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚5枚，37℃孵育72 h后，測定雞胚尿囊液的HA價，利用Reed-Muench法計算病毒的EID50。

1.6 病毒株的抗原性分析 分別將Re-9株和CQ58、LN37、GX35、FJ39、HuB46制備成滅活苗，分別免疫3只4周齡的SPF雞，制備抗血清，進行抗原性分析。按照文獻(xiàn)[8]方法計算各病毒株之間的抗原相關(guān)值（R），R=r1·r2×100%。R為抗原相關(guān)值，r1為血清1對病毒2的HI滴度與血清1對病毒1的HI滴度之比；r2為血清2對病毒1的HI滴度與血清2對病毒2的HI滴度之比。

1.7 滅活疫苗免疫效力試驗 將Re-9株滅活疫苗以0.3 ML/只的劑量免疫60只4周齡的SPF雞，取30只同日齡SPF雞作為對照。每周采血檢測HI抗體水平，免疫3周后，對免疫組雞與同條件飼養(yǎng)的對照雞，分別將親本HuN33病毒株和2010年～2011年所篩選的5個分離株H9N2亞型AIV以靜脈途經(jīng)接種，0.1m L/只（含2×107EID50）。攻毒后第3 d、5 d、7 d采集喉頭和泄殖腔拭子進行病毒分離，檢測排毒情況，病毒分離陰性樣品則盲傳1代。對免疫攻毒雞進行排毒檢測，喉頭或泄殖腔拭子病毒分離陽性均計為該只雞排毒。

2 結(jié)果

2.1 HA和NA基因的同源率比較 Re-9和HuN/33的HA和NA的核苷酸及氨基酸的同源性均為100%。5個分離株HA核苷酸之間的同源率為90.2%～96.4%，HA氨基酸之間的同源率為93.4%～97.4%；NA核苷酸之間的同源率為87.1%～96.5%，NA氨基酸之間的同源率為88.5%～96.0%。5個分離株與Re-9的HA核苷酸之間的同源率為90.6%～97.5%，HA氨基酸之間的同源率為92.9%～98.0%；NA核苷酸同源率為88.1%～98.7%，NA氨基酸之間的同源率為89.1%～98.3%。

其中FJ39的NA基因推導(dǎo)氨基酸序列的同源性與其余6株病毒株相差較大，HuB46的HA和NA基因及其氨基酸與其余6株病毒株同源性最相近。

2.2 病毒株EID50測定 病毒株通過SPF雞胚滴定結(jié)果顯示，每 0.1 ML的 HuN33、CQ58、LN37、GX35、FJ39和HuB46的病毒含量依次分別為108.6EID50、108.5EID50、109.3EID50、108.6EID50、108.8EID50和109.2EID50。

2.3 病毒株抗原性分析 對經(jīng)分別免疫2010年～2011年分離的5個代表株和Re-9株滅活疫苗而制備的抗血清進行交互血凝抑制試驗（表1）。

表1 AIV抗原性分析Table 1 Antigenicity analysis of AIV isolates

Re-9的抗原對5個分離株血清的交互HI值較高，并且各分離株對疫苗株血清的交互HI值的差異在2 log2以內(nèi)。用我國分離的H9N2亞型AIV早期 分 離 株 CK/GD/6/97（GD6）， DK/NJ/2/97（NJ2），CK/BJ/8/98（BJ8）和 CK/HB/31/00（HB31）血清對該 5個分離株抗原的HI抗體效價相差8 log2左右，存在較大差異；5個分離株之間的差異在4 log2左右。按照文獻(xiàn)[8]介紹的方法計算各病毒株之間的抗原相關(guān)值 R，R=r1·r2×100%（表 2）。

表2 5個分離株與疫苗株之間抗原相關(guān)值（R）測定結(jié)果Table 2 Antigen correlation value（R）of the H9N2 subtype AIVs

結(jié)果顯示5個分離株之間的抗原相關(guān)值為66.67%～100%，而Re-9株與該5個分離株之間的抗原相關(guān)值為88.89%～100%（表2）。

2.4 滅活疫苗免疫效力試驗 對相同條件下的免疫組和對照組雞只以2×107EID50靜脈途經(jīng)攻毒后，采集攻毒后3 d、5 d、7 d的喉頭和泄殖腔拭子，接種雞胚以檢測排毒情況，具體數(shù)據(jù)見表3。即對照組3 d時排毒的比例分別為：100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5），5 d時排毒的比例分別為：100%（5/5）、100%（5/5）、100%（5/5）、80%（4/5）、80%（4/5）、80%（4/5），而且攻毒后7 d依然有不同程度排毒。而免疫組在攻毒后3 d、5 d和7 d，拭子樣品病毒分離均為陰性，而且所有雞只在攻毒后14 d觀察期內(nèi)均無任何不良反應(yīng)，表明Re-9株滅活疫苗能夠?qū)?010年～2011年監(jiān)測到的病毒株攻擊提供良好的免疫作用。

表3 攻毒后拭子的病毒檢測結(jié)果Table 3 The virus shedding detection from trachea and cloaca swab samples post challenge

3 討論

由于H9N2亞型AIV為低致病力病毒，因此較少引起關(guān)注，而近幾年該病毒的分離率與以前相比明顯上升[9]。從HA遺傳進化樹上分析可知近幾年流行的H9N2亞型AIV仍為類A/CK/Beijing/1/94病毒株，但分析其序列表明當(dāng)前流行的病毒株與2009年以前病毒株相比已經(jīng)發(fā)生了變異，而且病毒不是限制在某些區(qū)域內(nèi)，而是在大范圍內(nèi)或全國流行。這與王壽山等[10]報道的相一致。由于H9N2亞型AIV具有上述特點，有研究者認(rèn)為有必要進行新的AI疫苗株的篩選[11]。許傳田等所篩選的疫苗株CK/SD/SG2/2009在攻毒后第3d有效保護率70%以上，第5 d保護率達(dá)到90%[12]。萬曉鵬等對2008年～2010年在我國不同地區(qū)監(jiān)測到的55個分離株AIV系統(tǒng)篩選，實驗結(jié)果表明CK/HuN/33/08是理想的疫苗候選株[7]。

疫苗株的基因同源性和抗原性差異是影響疫苗免疫效果的關(guān)鍵因素[13]。Re-9株與流行代表病毒株之間HA氨基酸的同源率為90.6%～97.5%，NA氨基酸同源率為88.1%～98.7%，并且其抗原相關(guān)值在88.89%～100%，Re-9的基因同源性和抗原性相關(guān)值均較高，在理論上具有典型疫苗株的特點。

HuN33具有良好的免疫原性，能夠?qū)Σ煌貐^(qū)和來源的流行病毒株的攻擊提供理想免疫保護，本實驗利用反向遺傳操作技術(shù)以HuN33的表面基因HA和NA基因及H1N1/PR8病毒的6個內(nèi)部基因為供體重組構(gòu)建疫苗毒Re-9株，并進行了系統(tǒng)評估。重組病毒對家禽和哺乳動物均呈低致病性，顯著降低了在疫苗研制和大生產(chǎn)過程中感染和傳播的風(fēng)險[14]。以Re-9株制備的滅活疫苗在攻擊親本株和2010年～2011年5個分離株后的保護率均為100%，表明Re-9株滅活疫苗不僅可以抵御同源病毒的攻擊，而且對5個異源病毒株的攻擊也具有較好的保護作用。因此，Re-9株是可用于當(dāng)前H9亞型AI預(yù)防的理想疫苗株。

[1]Alice F,Isabella M,Annalisa S,et al.Phylogeography and evolutionary history of reassortant H9N2 viruses with potential human health implications[J].Virology,2011,85:8413-8421.

[2]Li Cheng-jun,Yu Kang-zhen,Tian Guo-bin,et al.Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].Virology,2005,340:70-83.

[3]Kishidal N,Sakoda Y,Eto M,et al.Co-infection ofStaphylococcus aureusorHaemophilus paragallinarumexacerbates H9N2 influenza virus infection in chickens[J].Arch Virol,2004,149:2095-2104.

[4]Matrosovich MN,Krauss S,Webster R G.H9N2 influenza viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity[J].Virology,2001,281:156-162.

[5]Butt K M,Smith G J,Chen Hua-lan,et al.Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J].JClin Microbiol,2005,43:5760-5767.

[6]Ji Kang,Jiang Wen-m ing,Liu Shuo,et al.Characterization of the hemagglutinin gene of subtype H9 avian influenza viruses isolated in 2007-2009 in China[J].J Virol Meth,2010,163:186-189.

[7]萬曉朋，曾顯營，田國彬，等.H9N2亞型禽流感流行株滅活疫苗種毒的篩選[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32（4）：276-280.

[8]楊漢春.動物免疫學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995：146-147.

[9]趙坤坤，仲書官，趙國，等.2009-2010年華東地區(qū)家禽低致病性AIV的流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32（3）：345-349.

[10]王壽山，張超林，劉春國，等.H9N2亞型AIVHA和NA基因的序列分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，7：113-115.

[11]Suarez D L,Schultz S.Immunology of avian influenza viruses:a review[J].Dev Comp Immunol,2000,24:269-283.

[12]許傳田，魯梅，胡北俠，等.H9N2亞型禽流感疫苗株的篩選及其免疫效果評價[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32（7）：997-1000.

[13]卞學(xué)兵，曾嘉梅，周繼勇，等.免疫雞群中分離的H9N2亞型禽流感病毒的分子特征研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（1）：15-18.

[14]封柯宇，李洪濤，金龍女，等.重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗田間免疫效果觀察[J].中國家禽，2011，33（14）：49-50.