野木瓜三萜皂苷類化合物抗炎活性研究

張 倫 ，楊光忠 ，歐澤亮 ，楊 芳，王德彬＊

（1.中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2.拜爾斯道夫日化有限公司 研發(fā)部，武漢 430056）

野木瓜又名假荔枝根、假荔枝、繞繞藤、沙藤，為木通科野木瓜屬植物［1］.其根、莖、葉具有祛風(fēng)止痛及舒筋活絡(luò)的功效，臨床用于各種手術(shù)止痛及腫瘤止痛，對風(fēng)濕痛、各種神經(jīng)性頭痛、腰椎骨質(zhì)增生等療效顯著［2］.野木瓜中含有豐富的皂苷，主要包括去甲五環(huán)三萜皂苷類化合物［3－6］、木脂素類化合物［7－8］和黃酮苷類化合物［9］，此 外，還含有多糖、酚類化合物［10－11］等.已有研究表明野木瓜注射液具有抗炎鎮(zhèn)痛作用［12－13］.本課題組前期從野木瓜藤莖正丁醇部位分離得到的兩個(gè)三萜皂苷類化合物1、2，已有文獻(xiàn)對化合物1做了初步的抗腫瘤研究［14－15］，化合物2 的活性研究未見報(bào)道.因此，本研究擬對這兩個(gè)三萜皂苷類化合物進(jìn)行抗炎活性篩選，并探討其可能存在的機(jī)制.

圖1 化合物的結(jié)構(gòu)a.化合物1；b.化合物2Fig.1 The structure of the compounds a.3－O－α－L－rhamnopyranosyl－（1→2）－α－L－arabinopyranosyl－h(huán)ederagenin；b.3－O－α－L－arabinopyranosyl－（1→3）－α－L－rhamnopyranosyl－（1→2）－α－L－arabinopyranosyl－akebonic acid

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由本室凍存.

1.2 材料和試劑

野木瓜藤莖購自廣西南寧，經(jīng)廣西壯醫(yī)醫(yī)院副主任藥師黃錦威鑒定為木通科野木瓜屬植物，化合物1和2為課題組從其正丁醇提取物中分離出來，它們的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR 和ESIMS 確證［6，14］.LPS、地塞米松、Hochest33258（美國sigma公司）；胎牛血清（四季清公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Griess試劑盒（碧云天公司）；小鼠IL－1β試劑盒（達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.3 儀器

InfiniteM200型酶標(biāo)儀；DFC425C（12730222）型熒光倒置顯微鏡.

1.4 方法

1.4.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及傳代小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞加入含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞生長至70%～80%融合后進(jìn)行傳代，1～2d換液1次，3～4d傳代1次.

1.4.2 MTT 法檢測藥物對細(xì)胞活性的影響 按文獻(xiàn)［16］中 的MTT法，測定化合物1，2對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒活性.將生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞以每孔95μL（約1×104個(gè)）傳代培養(yǎng)于96孔板中，置于含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的化合物5μL，使其終濃度達(dá)到0，2.5，5，10，20，40，80μmol·L－1.溶劑對照組不加化合物，但加入DMSO 使其終濃度為0.2%（與高濃度化合物所含的DMSO 終濃度相同）.每組4個(gè)復(fù)孔.37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h 后，加入MTT 孵育4h后，棄上清，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，在492nm 處檢測吸光度A492.

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 將RAW264.7細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為1×104個(gè)／孔，加入96孔板內(nèi)，每孔85μL，每組4個(gè)復(fù)孔，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng).根據(jù)MTT檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分為6 組.各組處理方法：①正常組，只加培養(yǎng)基培養(yǎng)；②模型組，只加LPS，終濃度為10μg／mL；③陽性對照組，分別加入終濃度為10μg／mL LPS和10μmol·L－1地塞米松；④低、中、高劑量組，分別加入終濃度為10μg／mL LPS和5、10、20μmol·L－1化合物.

1.4.4 Griess法測定一氧化氮含量 按照1.4.3處理，培養(yǎng)72h后取細(xì)胞上清液采用Griess法，按NO 檢測試劑盒說明書操作.

1.4.5 ELISA 檢測IL－1β含量 根據(jù)Griess法檢測結(jié)果，選取化合物1按照1.4.3處理，培養(yǎng)72h后取細(xì)胞上清液采用ELISA 法，按試劑盒說明書操作.

1.4.6 Hochest33258熒光染色對細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察 通過Hochest33258 熒光染色法觀察化合物1促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡的作用.按照1.4.3處理，培養(yǎng)72h后棄上清，D－Hanks溶液洗一遍（盡量不吹打），加入固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）200μL／孔，4℃處理5 min 后用D－Hanks溶液洗一遍（盡量不吹打），加入5μg／mL Hochest33258染液50μL／孔，37℃孵育15～30min后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照.

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用表示，采用GraphPadPrism 統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1，2在0～20μmol·L－1濃度對RAW264.7細(xì)胞活力的影響與空白對照組相比，均無顯著性差異.說明化合物1，2在 這個(gè)濃度范圍內(nèi)對RAW264.7細(xì)胞無毒性，該結(jié)果為后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)，本研究所使用的藥物有效濃度，均在這一濃度范圍之內(nèi).

2.2 化合物1，2對炎性細(xì)胞NO 釋放的影響

圖2a 顯示不同濃度化合物1 對LPS 刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO 的影響；圖2b顯示不同濃度化合物2對LPS刺 激RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響.由圖2可知，正常組中RAW264.7細(xì)胞上清液NO 水平很低，給予10μg／mL LPS誘導(dǎo)72h后，NO 水平顯著增加.而實(shí)驗(yàn)組NO 釋放受到明顯抑制，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，化合物1，2在高劑量20μmol·L－1時(shí)抑制NO 釋放的強(qiáng)度高于陽性對照藥地塞米松（10μmol·L－1），且在高劑量時(shí)化合物1表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性.

圖2 不同濃度化合物對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO 的影響（與正常組比較：＊＊P＜0.01；與模型組比較：＃＃P＜0.01）Fig.2 The influence of produce NO with different concen trations of compounds in RAW264.7macrophages stimulated by LPS（Compared with the normal group：＊＊P＜0.01；Compared with the model group：＃＃P＜0.01）

2.3 化合物1對炎性細(xì)胞IL－1β產(chǎn)生的影響

IL－1β的分泌與藥物的濃度呈劑量依賴性關(guān)系，藥物高濃度對IL－1β的抑制率最高，隨用藥濃度的降低對IL－1β的抑制率逐漸下降.與模型組相比，化合物1在高、中、低三個(gè)濃度均對IL－1β的產(chǎn)生有強(qiáng)抑制作用，顯示出強(qiáng)的抗炎活性.結(jié)果見圖3.

圖3 不同濃度化合物1對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放IL－1β的影響（與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）Fig.3 The influence of produce IL－1βwith different concen trations of compound 1 in RAW264.7macrophages stimulated by LPS（Compared with the model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.4 化合物1促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

圖4a、4b分別為正常組、炎癥模型組細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈微弱熒光；圖4c～4f分別為陽性對照組、高濃度組、中濃度組、低濃度組細(xì)胞形態(tài)，其中正常細(xì)胞呈微弱熒光，凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色熒光且染色體固縮.給予不同濃度藥物可以觀察到不同程度的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，高濃度組觀察到了大量發(fā)出高亮熒光的固縮染色體，有明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象.

圖4 皂苷化合物1促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察（4a：正常細(xì)胞組；4b：LPS誘導(dǎo)組；4c：地塞米松組；4d：高濃度組；4e：中濃度組；4f：低濃度組）Fig.4 The observation of apoptosis with compound 1 in RAW264.7macrophages stimulated by LPS（4a：normal cell group；4b：LPS induced group；4c：dexamethasone group；4d：high dose group；4e：medium dose group；4f：low dose group）

3 討論

巨噬細(xì)胞是重要的抗炎免疫細(xì)胞，它在非特異性免疫、體液免疫以及腫瘤免疫等方面起著重要作用.LPS是巨噬細(xì)胞最有效的激活劑，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型已經(jīng)被廣泛用于炎癥反應(yīng)研究.當(dāng)RAW264.7 細(xì)胞受到LPS 的刺激時(shí)，可分泌大量炎癥因子.IL－1β是激活的巨噬細(xì)胞分泌的主要炎癥因子之一，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮非常重要的作用；一氧化氮（NO）是具有生物活性的氣體分子，是細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，并有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥毒性的功能.NO 的過量生成與炎癥密切相關(guān)［17］，在急性炎癥部位，致炎物質(zhì)和炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)或增加NO 的合成和釋放，NO 本身具有細(xì)胞毒性，還能與游離基團(tuán)反應(yīng)生成如ONOO－等的分子，導(dǎo)致毒性增加，從而促進(jìn)炎癥部位滲出和水腫［18］.本實(shí)驗(yàn)采用LPS 誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型，通過觀察野木瓜三萜皂苷類化合物1、2 對炎性細(xì)胞產(chǎn)生NO、IL－1β的影響，發(fā)現(xiàn)兩種化合物均劑量依賴性抑制NO釋放，且化合物1能抑制IL－1β的產(chǎn)生.

在炎癥反應(yīng)過程中，中性粒細(xì)胞和其它的滯留細(xì)胞通過凋亡機(jī)制，在膜完整狀態(tài)下被巨噬細(xì)胞識別和清除，從而避免繼發(fā)的炎癥反應(yīng).凋亡，是機(jī)體調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)展和防止炎癥后組織器官損傷與瘢痕形成的重要機(jī)制.近年來發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎與胰腺腺體細(xì)胞凋亡有關(guān)［19－21］，細(xì)胞凋亡參與了急性胰腺炎的發(fā)?。?2－23］.在眾多研究中也發(fā)現(xiàn)炎癥時(shí)細(xì)胞損傷釋放的一些無機(jī)小分子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及毒性物質(zhì)作用均會影響細(xì)胞的凋亡.這些細(xì)胞活性分子及一些應(yīng)激因素參與細(xì)胞的凋亡過程，在引導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控方面具有重要的意義［24］.本研究觀察到不同濃度化合物1 均可促進(jìn)炎性細(xì)胞發(fā)生凋亡，且高濃度時(shí)細(xì)胞凋亡明顯，推測可能是炎癥反應(yīng)中炎癥灶內(nèi)NO、IL－1β等炎癥因子促進(jìn)細(xì)胞凋亡，限制了炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大.

本文通過野木瓜兩種三萜皂苷化合物抑制炎性細(xì)胞NO，IL－1β等炎癥因子的釋放進(jìn)行抗炎活性篩選，兩種三萜皂苷化合物均具有一定的抗炎活性，其中化合物1具有較強(qiáng)的抗炎活性，其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制可能是通過抑制炎性因子的釋放進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的，本研究為進(jìn)一步探討野木瓜抗炎活性成分奠定了基礎(chǔ).

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