自噬在缺血預(yù)適應(yīng)減少急性心肌缺血-再灌注損傷中的作用＊

劉藝 徐衛(wèi)娟 柯麗 李云橋 彭雯，＃

缺血預(yù)適應(yīng)（Ischemic Preconditioning，IPC）［1］是機(jī)體減少缺血再灌注（Ischemia-Reperfusion，I／R）損傷最有效的內(nèi)源性保護(hù)措施之一。經(jīng)IPC 干預(yù)I／R 心肌后，其白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（Tumor Nectosis Factor-α，TNF-α）含量減少，可能是其保護(hù)I／R 心肌的一個(gè)重要途徑［2］。

自噬（Autophagy）廣泛存在于真核細(xì)胞中，可以降解和循環(huán)利用胞內(nèi)物質(zhì)如聚集的蛋白、某些病原體（分支桿菌和皰疹病毒）和多余或者損壞的細(xì)胞器（線粒體）等；當(dāng)缺氧或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，自噬可通過降解胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和脂肪酸為機(jī)體提供能量，并促進(jìn)機(jī)體蛋白和細(xì)胞器的合成。越來越多的證據(jù)顯示自噬的發(fā)生可減輕心肌I／R 損傷程度［3］；研究［4］發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)均可誘導(dǎo)自噬，如蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）、活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）、一氧化氮（NO）和腺苷一磷酸激活蛋白激酶（Adenosine Monophosphate-activated Protein Kinase，AMPK）等。心肌微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II（LC3-II）是自噬的標(biāo)記分子，定位于自噬前體和自噬體，可用于評(píng)價(jià)自噬強(qiáng)度。

本實(shí)驗(yàn)采用冠脈結(jié)扎術(shù)建立大鼠急性心肌I／R模型，研究IPC減少大鼠心肌I／R 損傷及自噬通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

雄性SD 大鼠32只，體重200～250g。均分為假手術(shù)組（Sham 組）、I／R 組、IPC 組和自噬抑制劑渥曼青霉素組（Wort組）。

1.2 主要試劑

兔抗鼠LC3B抗體（抗LC3-II一抗，美國(guó)Sigma公司）；BCA 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒和Protein A+G Agarose（中國(guó)碧云天生物公司）；原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick-end Labeling，TUNEL）試劑盒（DAB法，瑞士Roche公司）。

1.3 各組大鼠處理方法

1.3.1 大鼠急性心肌I／R 模型的制備：20%烏拉坦0.6ml／100g腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于解剖臺(tái)上，四肢皮下連接心電圖電極，監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（DH-140浙江）通氣。呼吸機(jī)設(shè)置：潮氣量8～10ml，呼吸頻率60～64次／min，呼吸比1∶3。于胸骨左緣2～3肋間開胸，“T”形剪開心包，在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐之間找到冠脈動(dòng)脈左前降支，將6-0無損傷線用手術(shù)縫合針穿至冠脈下，進(jìn)針深度控制在0.1cm，寬度0.1～0.2cm，之后對(duì)各組大鼠進(jìn)行如下處理：（1）Sham 組只穿線，不結(jié)扎冠脈，觀察150min；（2）I／R 組收緊結(jié)扎線并打結(jié)，心電圖Ⅱ?qū)?lián)S-T 段呈弓背向上抬高，同時(shí)肉眼見結(jié)扎區(qū)變白，證實(shí)心肌缺血。30min 后松開結(jié)扎線，再灌注120min；（3）IPC組于I／R 前結(jié)扎冠脈5min、松開再灌注5min，重復(fù)3次后，再結(jié)扎30min，再灌注120min；（4）Wort組：腹腔注射Wort（15μg／Kg），15min后結(jié)扎冠脈5min，松開再灌注5min，重復(fù)3次后，再結(jié)扎30min，再灌注120min。Sham 組、I／R組和IPC組同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水。

脫臼處死各組大鼠，迅速取出心臟，用冰冷生理鹽水沖洗，剪去非左心室部分，再剪取白色梗死心肌。分成三部分，一部分用于檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率；另一部分用于制作超薄切片，電鏡觀察自噬體數(shù)量和線粒體超微結(jié)構(gòu)變化；剩下部分-80℃冰箱中冷藏備檢LC3-II蛋白表達(dá)。Sham 組剪取相同部位心肌，作同樣處理。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將各組心肌樣本置于4%多聚甲醛中，4℃固定24h后，石蠟包埋制成組織切片。按TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行染色操作。由2個(gè)不同觀察者在每張切片上隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，以凋亡細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)（Apoptotic Index，AI）。細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色者為凋亡細(xì)胞。

1.4.2 自噬體和線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察：將各組心肌標(biāo)本于4℃2.5%戊二醛固定液中預(yù)固定5min，待軟組織稍變硬后再將組織修剪成截面積為1mm2的5mm 長(zhǎng)條（2條），室溫固定2h；用pH 7.4的PBS沖洗；l%鋨酸固定lh 再?zèng)_洗，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂（EPON812）包埋，超薄切片機(jī)（德國(guó)LEICA ULTRACUT UCT）切片；醋酸雙氧鈾及檸檬酸雙重染色，透射電子顯微鏡（荷蘭Tecnai G212型）觀察心肌自噬體數(shù)量及線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.4.3 Western Blotting檢測(cè)LC3-II蛋白表達(dá)：從-80℃冰箱中取出各組心肌標(biāo)本，加入3倍體積的組織裂解液，冰水浴中充分研磨成組織勻漿，放置10min；4℃15000g離心10min；加入蛋白上樣液，沸水煮5min。BCA 法定量蛋白濃度。加等量2×SDS上樣緩沖液，95℃變性5min。每孔加40μg胞漿蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE分離，4℃下100V 恒壓轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封膜2h，加入兔抗鼠抗LC3-II（1∶500）或內(nèi)參GAPDH（1∶800）一抗，于4℃孵育過夜；洗膜后與辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育1h；漂洗后ECL發(fā)光，常規(guī)顯影。用Gel pro 4.0凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以目的條帶灰度／內(nèi)參條帶灰度比值表示相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用Fisher LSD 法；均采用雙側(cè)檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞凋亡情況

凋亡細(xì)胞以心肌細(xì)胞為主，也可見淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。Sham 組僅見極少數(shù)散在凋亡細(xì)胞；I／R 組凋亡細(xì)胞較多，AI較Sham 組明顯增加（P＜0.01）；IPC組凋亡減少，AI較I／R 組明顯降低（P＜0.01）；而Wort組凋亡細(xì)胞最多，AI較IPC組明顯增加（P＜0.01）。見圖1和圖2。

圖2 各組心肌細(xì)胞AI比較

2.2 自噬體和線粒體超微結(jié)構(gòu)

電鏡下，Sham 組未見明顯自噬體，線粒體和心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常；I／R 組可見少量自噬泡，線粒體明顯腫脹，嵴突紊亂、斷裂或消失，心肌細(xì)胞水腫明顯，肌小節(jié)明暗帶模糊不清，肌絲斷裂溶解，細(xì)胞器減少、結(jié)構(gòu)破壞，胞漿內(nèi)形成大小不等的空腔和空泡，細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)容物泄漏等；IPC 組與I／R組相比，自噬泡數(shù)量增多，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷減輕；Wort組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞較IPC 組嚴(yán)重，且未見明顯自噬泡。見圖3。

2.3 各組LC3-II蛋白表達(dá)

Sham 組心肌組織LC3-II蛋白表達(dá)較少；I／R組及IPC組表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；IPC組較I／R組上調(diào)更顯著（P＜0.05）。見圖4。

［本文圖1、圖3見封2］

3 討論

自噬作為有別于細(xì)胞凋亡的第二類程序性細(xì)胞死亡途徑，已證實(shí)廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，是一種溶酶體依賴性降解途徑。在機(jī)體細(xì)胞發(fā)育、蛋白合成、組織重塑及環(huán)境適應(yīng)等方面發(fā)揮著極其重要的作用［5］。自噬最基本的功能是當(dāng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足時(shí)通過降解胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，滿足細(xì)胞必要的能量需求和合成反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激狀況。

圖4 各組大鼠心肌組織LC3-II蛋白表達(dá)

IPC是一種內(nèi)源性心肌保護(hù)方法，既往研究證實(shí)IPC可減少心肌I／R 過程中過多的氧自由基，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，降低能量消耗和抑制去甲腎上腺素的過度分泌等機(jī)制，發(fā)揮心肌保護(hù)作用［6］。

Decker等［7］最早報(bào)道了I／R 可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，該研究發(fā)現(xiàn)兔的心肌細(xì)胞在經(jīng)歷了20～40min的缺氧后，開始出現(xiàn)自噬泡，而當(dāng)氧供恢復(fù)后，自噬泡數(shù)量明顯增加，且在急性或慢性缺血條件下自噬均可被啟動(dòng)，在再灌注階段自噬又會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)；此外，Kim 等［8］觀察到處于冬眠狀態(tài)的心肌細(xì)胞內(nèi)，也可觀察到自噬增強(qiáng)，同時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡水平下降，心肌梗死面積減少。可見自噬可通過降解胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和脂肪酸，為機(jī)體提供能量，促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的合成，從而維持缺血缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的存活。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠急性心肌I／R 模型，觀察到I／R 組有少量自噬泡，心肌細(xì)胞線粒體腫脹，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞明顯；IPC組與I／R 組相比，自噬泡數(shù)量明顯增多，細(xì)胞器如線粒體損傷也減輕；而Wort組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞較IPC 組嚴(yán)重，且未見明顯自噬泡。LC3是酵母自噬相關(guān)基因Atg 8的類似物，其前體（ProLC3）形成后，被Atg 4剪切形成胞漿可溶性形式的LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸殘基。LC3-I再被Atg 7活化，轉(zhuǎn)運(yùn)至第2種E2樣酶Atg 3，并被修飾成膜結(jié)合形式的LC3-II。LC3-II作為評(píng)價(jià)自噬強(qiáng)度的指標(biāo)，在本研究的I／R組中表達(dá)較Sham 組明顯上調(diào)，IPC 組比I／R 組表達(dá)更多。推測(cè)IPC可通過適量增強(qiáng)自噬強(qiáng)度，為心肌細(xì)胞提供更多能量，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。其機(jī)制有待深入研究。

既往研究已證實(shí)自噬可通過抑制溶酶體Na+／H+質(zhì)子泵，減少胞內(nèi)Na+濃度，繼而減少Na+／Ca2+交換，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載［9］，避免線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Mitochordrial Permeability Transition Pore，mPTP）開放，從而減少促凋亡物質(zhì)如細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）、凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis Induced Factor，AIF）等的釋放，減少心肌細(xì)胞凋亡。自噬對(duì)凋亡的抑制作用還與自噬體包裹損傷的線粒體有關(guān)，因而不但阻止了Cyt C 釋放入細(xì)胞質(zhì)，而且可以抑制凋亡小體的形成［10］。

自噬的調(diào)控通路可分為mTOR（Mammalian Target of Rapamycin）調(diào)節(jié)途徑和mTOR 不依賴性調(diào)節(jié)途徑［11］。在缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下，自噬的發(fā)生主要由mTOR 途徑調(diào)控，自噬體的形成依賴于III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶（Class III Phosphatidylinositol 3-Kinase，Class III PI3K）的作用［12］。Class III PI3K 抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）、渥曼青霉素可激活mTOR，由此干擾或阻斷自噬小體的形成，減少細(xì)胞自噬發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)在IPC 前用渥曼青霉素抑制自噬后，IPC的心肌保護(hù)作用被減弱，表明自噬可在IPC減少I／R 損傷中發(fā)揮重要作用。

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