TLR4／NF-κB在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中的表達(dá)及CRX-526的抑制作用＊

黃宏耀 劉方方 張秋瑩 劉國(guó)政 錢進(jìn)

眾所周知，Toll樣受體（Toll-like Receptor，TLRs）是重要的細(xì)胞表面受體家族，參與機(jī)體對(duì)外源性生物的識(shí)別和免疫應(yīng)答，且對(duì)腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究［1，2］表明，TLRs可通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式（Pathogen-Associated Molecular Pattern，PAMPs）及某些內(nèi)源性配體，引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放，是天然免疫防御和獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁。TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員之一，表達(dá)于多種細(xì)胞表面，在固有免疫中發(fā)揮著重要作用［3］。TLR4通過(guò)識(shí)別PAMPs，經(jīng)過(guò)髓樣分化蛋白分子（Myeloid Differentiation Factor 88，MyD88）依賴性信號(hào)傳導(dǎo)分子激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）［4］，使之與抑制蛋白IκBα（IΚB）解離，進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)多種基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞釋放大量炎癥相關(guān)因子，造成組織損害［5］。

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，死亡率高，且發(fā)病率逐年上升。研究結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及其潛在的治療靶點(diǎn)和藥物，具有重要的意義。因此，本研究利用脂多糖（LPS）刺激人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，觀察TLR4／NF-κB 通路蛋白在受LPS刺激的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化；并通過(guò)裸鼠移植瘤試驗(yàn)，探討TLR4拮抗劑CRX-526對(duì)結(jié)腸癌的治療作用。

1 資料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑

人結(jié)腸癌SW620、LPS（E.coli O111：B4）、CRX-526，Trizol Reagent（美國(guó)Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Toyobo公司）；熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（美國(guó)ABI公司）；NF-κB（p65）抗體（美國(guó)Ebioscience公司）；Super-Signal ECL kit（美國(guó)Pierce公司）；蛋白提取試劑盒（中國(guó)碧云天生物Beyotime 公司）；IL-6、IL-8 ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB／c-nu無(wú)胸腺裸鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，28日齡，雄性。

下述引物均由上海英俊公司合成。

TLR4引物上游序列：5’-AGC CAC CTC TCT ACC TTA ATA TTG A-3’，下游序列：3’-CCG AGT GTT AGA ATA GGT TAG AAA G-5’；NFκB（p65）DH 引物上游序列：5’-AGC CAC CTC TCT ACC TTA ATA TTG A-3’，下游序列：3’-CCG AGT GTT AGA ATA GGT TAG AAA G-5’；GAPDH 18S內(nèi)參上游引物序列：5’-CCG AGA AGT TTC AGC ACA TCC-3’，下游序列：3’-TGG CAG TGA TAG CGA AGG CT-5’。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理：培養(yǎng)原代SW620細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用含0.01%EDTA 的0.25%胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×103／ml，于37℃，5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜，D-PBS洗滌兩次后，LPS刺激組加入含10μg／L LPS 的RPMI 1640培養(yǎng)基，無(wú)刺激組加入不含LPS 的RPMI 1640培養(yǎng)基，再培養(yǎng)6h后收獲細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2 Real-time PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)：將上述兩組再培養(yǎng)細(xì)胞分別按照Trizol試劑說(shuō)明書提取TLR4和NF-κB（p65）總RNA，去除基因組DNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20μl。PCR 體系中依次加入cDNA 模板、上下游引物各900nmol／L，SYBR Green PCR Master mix 12.5μl至EP管中，補(bǔ)水至總體積25μl。每個(gè)檢測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行孔，取平均值作為該樣本拷貝數(shù)值評(píng)價(jià)其mRNA 表達(dá)水平。PCR 程序?yàn)椋?5℃變性5min，94℃、60℃、72℃各20s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.3 Western Blotting 檢測(cè)TLR4和NF-κB（p65）蛋白表達(dá)：按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取1.2.1兩組再培養(yǎng)細(xì)胞，蛋白變性后行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳電壓200V。電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，制作濾紙-凝膠-膜“三明治”，極恒流300mA 轉(zhuǎn)移70min，于加樣槽中加入相應(yīng)的一抗1ml（1∶300），室溫下于搖床孵育，用含吐溫20的磷酸緩沖鹽水洗滌10min，每個(gè)加樣槽中加入二抗1ml，室溫下于搖床孵育1h，ECL 底物化學(xué)發(fā)光，暗室曝光5～30s，照相。電泳結(jié)果采用Gelpro 3.2凝膠光密度分析軟件處理，以樣本平均光密度值（IOD）與內(nèi)參GAPDH 的IOD 值之比表示TLR4和NF-κB（p65）蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)IL-6和IL-8：按照說(shuō)明書梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本的培養(yǎng)上清，37℃溫育30min。洗滌液洗滌6次，拍干后加入酶標(biāo)試劑50μl，37℃溫育30min。洗滌液洗滌6次后，每孔分別加入顯色劑A 和B 各50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。每孔加終止液50μl，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔吸光度（OD 值），并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲取IL-6和IL-8含量（pg／ml）。

1.2.5 裸鼠成瘤及CRX-526抑制試驗(yàn)：將試驗(yàn)用裸鼠隨機(jī)分成抑制組和非抑制組，每組20只，均于前肢上段皮下注射LPS刺激培養(yǎng)（1×106個(gè)）的SW620細(xì)胞。各鼠于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由飲食，觀察其活動(dòng)程度及雙目是否有神。4周后抑制組用50μg TLR4拮抗劑CRX-526每日對(duì)瘤體進(jìn)行多點(diǎn)注射1次，連續(xù)注射5天［6，7］。非抑制組平行注射等量生理鹽水，余與抑制組同樣處理。4周后兩組裸鼠生長(zhǎng)良好，無(wú)死亡。麻醉處死裸鼠并摘除腫瘤，測(cè)量腫瘤體積后切取部分腫瘤組織，勻漿后分成兩份，一份按1.2.2方法進(jìn)行Real-time PCR 檢測(cè)TLR4和NF-κB（p65）mRNA，另一份按1.2.3方法進(jìn)行Western Blotting分析TLR4和NF-κB（p65）蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行各組比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 刺激培養(yǎng)SW620細(xì)胞的TLR4和NFκB（p65）mRNA 和蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，LPS 刺激組TLR4和NF-κB（p65）mRNA 的拷貝數(shù)明顯高于無(wú)刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；LPS 刺激組TLR4和NF-κB（p65）蛋白相對(duì)表達(dá)量較無(wú)刺激組顯著上升，見(jiàn)表1、圖1。

2.2 LPS刺激培養(yǎng)SW620細(xì)胞的IL-6和IL-8水平

結(jié)果顯示LPS抑制組IL-6和IL-8水平較無(wú)刺激組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組培養(yǎng)SW620細(xì)胞TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷貝數(shù)和IL-6和IL-8表達(dá)水平（±s，n均=3）

表1 兩組培養(yǎng)SW620細(xì)胞TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷貝數(shù)和IL-6和IL-8表達(dá)水平（±s，n均=3）

注：與無(wú)刺激組比較，1）P＜0.05

2.3 CRX-526對(duì)移植瘤生長(zhǎng)和TLR4／NF-κB（p65）表達(dá)的抑制作用

2.3.1 CRX-526抑制移植瘤生長(zhǎng)：裸鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞后，第3天即可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，及至第4周末，且邊界清淅，擠壓可活動(dòng)。兩組各有14只裸鼠成瘤，無(wú)鼠死亡，另12只未成瘤。注射CRX-5264周后，抑制組腫瘤體積分別明顯小于非抑制組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

2.3.2 CRX-526抑制TLR4和NF-κB（p65）mR-NA 和蛋白表達(dá)：抑制組TLR4和NF-κB（p65）mRNA 的拷貝數(shù)顯著低于非抑制組（P均＜0.05）。抑制組TLR4和NF-κB（p65）蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于非抑制組（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖3。

表2 兩組裸鼠腫瘤體積和TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷貝數(shù)比較（±s，n均=14）

表2 兩組裸鼠腫瘤體積和TLR4、NF-κB（p65）mRNA拷貝數(shù)比較（±s，n均=14）

注：與非抑制組比較，1）P＜0.05

圖1 LPS對(duì)SW620細(xì)胞TLR4、NF-κB（p65）蛋白表達(dá)的影響

圖3 TLR4拮抗劑CRX-526對(duì)移植瘤TLR4、NF-κB（p65）表達(dá)的影響

［本文圖2見(jiàn)封2］

3 討論

結(jié)腸癌是多種因素綜合作用的結(jié)果，其病因與年齡、飲食、遺傳、炎癥等有關(guān)，特別是慢性結(jié)腸炎，其發(fā)展為結(jié)腸癌的幾率較高［8］。TLR4不僅在炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且很可能與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［9］。在筆者的前期工作證實(shí)結(jié)腸癌組織標(biāo)本的TLR4、NF-κB 及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)高于癌旁正常結(jié)腸組織［10，11］。本文進(jìn)一步觀察LPS 刺激培養(yǎng)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的TLR4和NF-κB（p65）mRNA 和蛋白的表達(dá)，并探討TLR 抑制劑CRX-526對(duì)其的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞后，TLR4 mRNA 和蛋白水平均明顯上調(diào)，NF-κB（p65）表達(dá)也明顯增加，表明LPS 能激活TLR4／NF-κB信號(hào)通路。TLR4／NF-κB 信號(hào)通路被激活后，其下游的炎癥相關(guān)因子IL-6和IL-8的表達(dá)水平隨之升高，與TLR4、NF-κB（p65）的表達(dá)趨勢(shì)一致，說(shuō)明LPS刺激結(jié)腸癌SW620細(xì)胞后，通過(guò)激活TLR4／NF-κB信號(hào)通路能誘導(dǎo)IL-6和IL-8的表達(dá)。與Li等［12］研究表明的IL-6參與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌的發(fā)生，以及Lee等［13］發(fā)現(xiàn)腫瘤組織微環(huán)境中高表達(dá)IL-8及其受體CXCR2可促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的結(jié)果相同。

為了探討TLR4是否可以作為結(jié)腸癌的治療新靶點(diǎn)，本文利用SW620結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行了裸鼠移植瘤試驗(yàn)，并用TLR4拮抗劑CRX-526對(duì)移植瘤進(jìn)行多點(diǎn)注射。結(jié)果表明，CRX-526能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)證實(shí)相關(guān)分子TLR4、NF-κB（p65）的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。提示TLR4／NF-κB 信號(hào)通路是結(jié)腸癌生長(zhǎng)抑制的重要途徑，可作為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)，而且TLR4拮抗劑CRX-526對(duì)結(jié)腸癌具有潛在治療價(jià)值。

總之，本資料對(duì)探討炎癥與腫瘤的相互關(guān)系以及TLR4／NF-κB信號(hào)通路作為結(jié)腸癌的治療靶點(diǎn)獲得初步結(jié)果，為今后的臨床應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 Heayat M，Takeda K，Rezaei N.Prophylactic and therapeutic implications of toll-like receptor ligands［J］.Med Res Rev，2012，32（2）：294～325.

2 Lee CC，Avalos AM，Ploegh HL.Accessory molecules for Tolllike receptors and their function［J］.Nat Rev Immunol，2012，12（3）：168～179.

3 Perros F，Lambrecht BN，Hammad H.TLR4signalling in pulmonary stromal cells is critical for inflammation and immunity in the airways［J］.Respir Res，2011，12（1）：125～132.

4 Stoll LL，Denning GM，Weintraub NL.Endotoxin，TLR4signaling and vascular inflammation：potential therapeutic targets in cardiovascular disease［J］.Curr Pharm Des，2006，12（32）：4229～4245.

5 Gimore TD，Wolenski FS.NF-kappa B：where did it come from and why？［J］.Immunol Rev，2012，246（1）：14～35.

6 Tone F.Bathen，Kristin.Omega-3fatty acids suppress growth of SW620human colon cancer xenografts in nude mice［J］.Anticancer Resarch，2008，28：3717～3724.

7 Fort MM，Mozaffarian A，St?ver AG.A synthetic TLR4antagonist has anti-inflammatory effects in two murine models of inflammatory bowel disease［J］.J Immunol，2005，174（10）：6416～6123.

8 Li H，Xu H，SUN B.Lipopolysaccharide regulates MMP-9expression through TLR4／NF-κB signaling in human arterial smooth muscle cells［J］.Mol Med Report，2012，6（4）：774～778.

9 Zhou B，Zhou H，Ling S，et al.Activation of PAR2or／and TLR4promotes SW620cell proliferation and migration via phosphorylation of ERK1／2［J］.Oncol Rep，2011，25（2）：503～511.

10 黃宏耀，陳巍巍，劉方方，等.TLR4和NF-κB p65表達(dá)與結(jié)腸癌的關(guān)系［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（10）：953～957.

11 黃宏耀，陳巍巍，張秋瑩，等.結(jié)腸癌組織中Toll樣受體4基因表達(dá)［J］.微循環(huán)學(xué)雜志，2010，20（1）：65～66.

12 Li Y，Deuring J，Peppelenbosch MP，et al.IL-6-induced DNMT1activity mediates SOCS3promoter hypermethylation in ulcerative colitis-related colorectal cancer［J］.Carcinogenesis，2012，33（10）：1189～1196.

13 Lee YS，Choi I，Ning Y，et al.Interleukin-8and its receptor CXCR2in the tumour microenvironment promote colon cancer growth，progression and metastasis［J］.Br J Cancer，2012，106（11）：1833～1841.