腦梗死急性期患者血小板膜糖蛋白Ia C807T基因多態(tài)性和血小板功能

沈明強(qiáng) 石冬敏＊ 戴蘭

腦梗死是多病因、多致病基因疾病，血小板活化、黏附和聚集在急性腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［1～3］。血小板膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）是一種存在于血小板質(zhì)膜表面的糖蛋白，是細(xì)胞黏附受體整合素家族成員，對(duì)血小板黏附和聚集過程有重要作用［4］。GPIa／IIa是血小板表面主要的膠原受體，通過GPIa／IIa的橋連，血小板黏附到血管內(nèi)皮下暴露的膠原上，隨之被活化。編碼GP的基因具有高度多態(tài)性。基因的突變可能導(dǎo)致血小板活化和聚集功能的改變，增加血栓性疾病的危險(xiǎn)。而P 選擇素（CD62P）是反映血小板活化最具有特異性的分子標(biāo)記物之一，血小板最大聚集率（MAR）可反映血小板活化后黏附、聚集的程度［5，6］。因此本研究通過觀察腦梗死急性期患者基因GPIa 807C／T 多態(tài)性，探討其與血小板活化和聚集功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

（1）腦梗死組：選擇2010年10月～2012年3月在本院住院的腦梗死患者97例，男59例，女38例；年齡30～92歲，平均66.51±11.21歲；病程6～48h，平均13.78±4.68h。均為首次發(fā)病，符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，并經(jīng)頭顱CT 或MRI檢查證實(shí)。包括大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中（LAA）50例，小動(dòng)脈閉塞性卒中（SAO）47例。（2）對(duì)照組：系同期本院正常健康體檢者99例，男62例，女37例；年齡35～91歲，平均69.18±10.22歲；均無心腦血管病。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）感染、腫瘤、肝腎疾病、自身免疫性疾病、心血管病和下肢動(dòng)靜脈血栓形成者；（2）近1個(gè)月內(nèi)服用過阿司匹林、潘生丁、氯吡格雷等影響血小板藥物者；（3）需要溶栓、降纖、抗凝治療的患者。研究對(duì)象或家屬均知情同意。

1.2 檢測(cè)方法

腦梗死組在發(fā)病48h內(nèi)（治療前），對(duì)照組在體檢當(dāng)日抽取靜脈血6ml。EDTA-K2抗凝4ml，用作基因多態(tài)性分析（2ml）和CD62P 檢測(cè)（2ml）；枸櫞酸鈉抗凝2ml，用作血小板MAR 測(cè)定。

1.2.1 GPIa 807C／T 位點(diǎn)多態(tài)性分析：采用PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Polymerase Chain Reaction Restriction-Fragment Length Polymorphism，PCR-RELP）法檢測(cè)。目的片斷約184bp，上游引物：5’-GTG TTT AAC TTG AAC ACA TAT-3’，下游引物：5’-ACC TTG CAT ATG AAT TGC TT-3’。PCR 反應(yīng)體系為25μl，Taq Master Mix（含0.1U Taq DNA 聚合酶，20mmol Tris-HCl，100mmol KCl，3mmol MgCl2，500μmol dNTP）8μl，上下游引物分別為2μl（10mmol／L）、DNA 模板2μl，加雙蒸水至總體積為25μl。PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。取PCR 產(chǎn)物10μl，瓊脂糖凝膠（20g／L）電泳，紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。酶切反應(yīng)體系為20μl：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，TaqI內(nèi)切酶5U，雙蒸水8μl。65℃水浴90min，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠（20g／L）電泳，紫外凝膠成像儀下觀察并照相，通過PCR 條帶判斷PCR 酶切產(chǎn)物的長(zhǎng)度，確定基因型。

1.2.2 血小板CD62P表達(dá)率檢測(cè)：用全血流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取10μl全血，加入PE標(biāo)記的CD62P單克隆抗體（CD62P-PE，美國(guó)Becton-Dickinso公司），采用FC-500流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司），按常規(guī)方法檢測(cè)，計(jì)數(shù)CD62P 陽性血小板百分比，結(jié)果以百分率（%）表示。

1.2.3 血小板MAR 檢測(cè)：用比濁法檢測(cè)。采用LBY-NJ2血小板聚集儀（北京普利生公司）檢測(cè)花生四烯酸（AA，上海度生公司）誘導(dǎo)的血小板最大聚集率（MARAA）和二磷酸腺苷（ADP，普利生公司）誘導(dǎo)的血小板最大聚集率（MARADP）。AA 終濃度為200mg／L，ADP終濃度為11.2μmol／L。使用儀器配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)控。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示?；蝾l率分析比較采用χ2檢驗(yàn)；組間均數(shù)比較采用方差分析F 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組和對(duì)照組GPIa基因型及等位基因頻率分布

腦梗死組TT 基因型和T 等位基因頻率高于對(duì)照組（χ2分別為7.615和5.369），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 腦梗死組與對(duì)照組GPIa基因型及等位基因頻率分布

2.2 不同基因型腦梗死組與對(duì)照組血小板CD62P表達(dá)率、MARAA、MARADP比較

腦梗死組與對(duì)照組TT+CT 基因型MARADP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），腦梗死組CC基因型MARADP、TT+CT 基因型和CC 基因型MARAA、CD62P表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。腦梗死組TT+CT 基因型與CC基因型之間MARAA、MARADP、CD62P差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組TT+CT 基因型與CC基因型之間MARAA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MARADP、CD62P表達(dá)率高于CC 基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 腦梗死組與對(duì)照組不同基因型血小板CD62P表達(dá)率、MARAA、MARADP比較（±s，%）

表2 腦梗死組與對(duì)照組不同基因型血小板CD62P表達(dá)率、MARAA、MARADP比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與同組CC基因型比較，3）P＜0.01

3 討論

腦梗死的發(fā)生大多因動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和血栓形成所致。動(dòng)脈造影發(fā)現(xiàn)90%以上腦梗死患者發(fā)病8h以內(nèi)均可見到血栓，其中多數(shù)為紅色血栓。GP是血小板表面的膠原受體，通常以GPIa-IIa復(fù)合物形式存在，主要介導(dǎo)血小板黏附于膠原，是啟動(dòng)血小板活化的重要步驟，因此GP 表達(dá)差異與血小板功能密切相關(guān)。目前認(rèn)為GPIa基因多態(tài)性是GP個(gè)體表達(dá)的重要因素。GPIa C807T 是GPIa最重要的多態(tài)位點(diǎn)。Kunicki等［8］的研究顯示，C807T純合子受試者血小板膜上GPIa／IIa受體密度增加4倍，可導(dǎo)致膠原結(jié)合增多，血小板活化和聚集增加。

GPIa C807T 與缺血性卒中發(fā)病關(guān)系的研究結(jié)果不盡一致。Cole等［9］的研究未發(fā)現(xiàn)GPIa C807T多態(tài)性與缺血性腦卒中的首次發(fā)病相關(guān)。de Oliveira等［10］的研究不支持GPIa C807T 基因多態(tài)性與未確定病因的缺血性腦卒中發(fā)病獨(dú)立相關(guān)。而Luk等［11］的研究發(fā)現(xiàn)GPIa C807T 多態(tài)性與中國(guó)糖尿病人群缺血性卒中發(fā)病獨(dú)立相關(guān)。Nikolopoulos等［12］的Meta分析不支持GPIa C807T 與缺血性腦卒中發(fā)病的相關(guān)關(guān)系，但同時(shí)也指出小樣本的Meta分析結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎看待。這些研究結(jié)果不盡一致的原因可能是：（1）研究對(duì)象的種族不同，因而基因分布不同；（2）研究樣本數(shù)量太?。唬?）對(duì)缺血性卒中病人的選擇有偏倚，未排除發(fā)病與血小板活化無關(guān)的病人，如心源性腦梗死等。本研究選擇了50例LAA和47例SAO，結(jié)果表明，腦梗死組TT 基因型和T等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），提示GPIa C807T 與缺血性卒中發(fā)病有關(guān)，GPIa C807T等位基因攜帶者可能是腦梗死的一個(gè)遺傳性危險(xiǎn)因素。攜帶C807T 等位基因的個(gè)體，血小板表達(dá)高水平GPIa／IIa，且純合子TT 與雜合子CT 的GPIa／IIa表達(dá)數(shù)量相似。GPIa基因編碼區(qū)807位C 至T的替換，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和表達(dá)異常，使血漿GPIa／IIa濃度增加，從而促進(jìn)血小板活化和黏附、聚集，加速動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，CC基因型腦梗死組CD62P 表達(dá)率和 MARAA、MARADP均高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）；腦梗死組TT+CT 基因型CD62P 表達(dá)率和MARAA亦高于對(duì)照組（P＜0.01），提示腦梗死患者血小板活化程度、聚集率均高于對(duì)照組。對(duì)照組TT+CT基因型的CD62P 表達(dá)率和MARADP高于CC 基因型，但腦梗死組TT+CT 基因型的CD62P 表達(dá)率和MARAA、MARADP與CC基因型無顯著差異，可能是因?yàn)镃807T 等位基因的個(gè)體血小板表達(dá)高水平GPIa／IIa，使血小板高度活化而促進(jìn)腦梗死發(fā)生。但腦梗死發(fā)生后，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮下膠原暴露，CD62P 表達(dá)升高，隨之多種血小板活性物質(zhì)釋放，級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致血小板MAR 在腦梗死組不同等位基因攜帶者間無顯著差異［13，14］。

綜上所述，動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病機(jī)制是腦動(dòng)脈內(nèi)血栓形成，血栓形成的根源是內(nèi)皮細(xì)胞損傷，關(guān)鍵是血小板活化、聚集。GPIa C807T 等位基因型攜帶者血小板功能增強(qiáng)，可能是腦梗死發(fā)病的一個(gè)遺傳性危險(xiǎn)因素。

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