二氯乙酸鈉聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞株凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

單輝國(guó)，茅國(guó)新，潘驥群，周雪峰

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，肺癌發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的首位，近年來(lái)，我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率也一直呈明顯上升趨勢(shì)。非小細(xì)胞肺癌(Nun-small cell lung cancer，NSCLC)為肺癌最常見(jiàn)類(lèi)型，在肺癌中約占80%，雖然近年來(lái)多學(xué)科綜合治療模式的進(jìn)展使得NSCLC的治療效果顯著提高，但NSCLC的5年生存率仍然低于15%［1］。因此，探索新的治療模式、新的治療藥物是肺癌研究的熱點(diǎn)之一。Bonnet等［2］經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，用于治療乳酸酸中毒和線(xiàn)粒體遺傳性疾病的小分子藥物二氯乙酸鹽(DCA)可以在體外殺死肺、腦、乳腺、子宮內(nèi)膜多種腫瘤細(xì)胞，同時(shí)，DCA能激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體的功能，從而激活細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路，達(dá)到殺傷癌細(xì)胞的目的。Cao等［3］研究也證實(shí)了DCA可誘導(dǎo)前列腺腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察二氯乙酸鈉(DCA-Na)、DDP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株的影響，為DCA-Na臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DDP購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司;DCA-Na購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司;人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物研究所細(xì)胞庫(kù);四氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Sigma公司;RPMI-1640購(gòu)自GIBCO。所有細(xì)胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，pH值為6.8～7.2，培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，48 h換液一次。

1.2 MTT法檢測(cè)DCA-Na、DDP對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞(每孔含細(xì)胞數(shù) 1×105/mL)種入 96孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL培養(yǎng)基。置37℃、95%濕度、含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別加入:單藥組DCA-Na的終濃度分別為18.75、37.5、75、150、300 μg/mL;單藥組 DDP 的終濃度分別為 0.08、0.4、2、10、50 μg/mL;細(xì)胞對(duì)照組(細(xì)胞液 100 μL+RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL)。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每塊板設(shè)一個(gè)空白組，只加等量的RPMI 1640培養(yǎng)液，不含細(xì)胞與藥物。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL。把96孔板置于搖床上搖動(dòng)1 min，以充分混勻待檢測(cè)體系，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4～6 h。每孔加入100 μL的DMSO，輕輕震蕩10 min。用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，取平均OD值。按以下公式計(jì)算各組抑制率(IR)fa=［1-處理組OD值/對(duì)照組OD值］×100%。

1.3 MTT法檢測(cè)DCA-Na聯(lián)合DDP對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 DDP終濃度0.08、0.4、2 μg/mL分別與 DCA-Na 終濃度為 18.75、37.5、75、150、300 μg/mL聯(lián)合，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(加 A549細(xì)胞)、不加藥物空白組(不加A549細(xì)胞及藥物，只加培養(yǎng)液)。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL。每孔加入100 μL的DMSO，輕輕震蕩10 min。用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，取平均OD值。按以下公式計(jì)算各組抑制率(IR)fa=［1-處理組OD值/對(duì)照組OD值］×100%。按金氏公式［4］判斷DCA-Na和DDP聯(lián)用的性質(zhì)Q=E(A+B)/［EA+(1-EA)×EB］。E(A+B)為兩藥合用的抑制率，EA、EB為兩藥單用的抑制率。Q=0.85～1.15表示兩藥作用相加，Q＞1.15表示兩藥作用協(xié)同，Q＜0.85表示兩藥作用相互拮抗。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集24、48、72 h 經(jīng) DCA-Na 75 μg/mL、DDP 2 μg/mL 單獨(dú)及聯(lián)合作用的細(xì)胞，并用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，使用未加藥細(xì)胞作為對(duì)照組，按常規(guī)消化收集;按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明，取100 μL的細(xì)胞懸液加入5 mL流式管中，并加入5 μL FITC 和 10 μL 20 μg/mL PI的溶液;在反應(yīng)管中加入400 μL PBS，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm);各組細(xì)胞均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 Caspase-3、8、9活性檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為4組:未加藥細(xì)胞對(duì)照組、DCA-Na 37.5、75、150 μg/mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12、24、48、72 h，定時(shí)取樣檢測(cè)。Caspase-3、8、9 活性檢測(cè)按 Caspase-3、8、9 分光光度法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，進(jìn)行方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DCA-Na對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用 濃度為 18.75、37.5、75、150、300 μg/mL的DCA-Na分別作用于A549細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，OD值下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DCA-Na作用于A549細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度(Half inhibitory concentration，IC50)值 為140.21 μg/mL。

2.2 DDP對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用 濃度為0.08、0.4、2、10、50 μg/mL 的 DDP 分別作用于A549細(xì)胞后，其OD值與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DDP作用于A549 細(xì)胞 48 h 的 IC50為1.42 μg/mL。

2.3 DCA-Na聯(lián)合DDP對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用 濃度為 18.75、37.5、75、150 μg/mL的 DCA-Na 分別與0.08、0.4、2 μg/mL的DDP聯(lián)合作用于A549細(xì)胞后，其OD值與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。濃度為 18.75、37.5、75、150 μg/mL 的 DCA-Na 分別與0.08 μg/mL的 DDP聯(lián)合，其抑制率與同濃度DDP單藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。濃度為 37.5、75、150 μg/mL 的 DCA-Na 分別與0.4、2 μg/mL的 DDP聯(lián)合，其抑制率與同濃度DDP單藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。按照兩藥合用效果公式計(jì)算，濃度為75 μg/mL的 DCA-Na與2 μg/mL 的 DDP 聯(lián)合在48 h的Q值為1.16，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)FCM檢測(cè)，75 μg/mL DCA-Na、2 μg/mL DDP 單獨(dú)及聯(lián)合作用于A549細(xì)胞24、48、72 h后，A549細(xì)胞凋亡率見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，A549細(xì)胞經(jīng)DCA-Na和DDP單獨(dú)及聯(lián)合作用后出現(xiàn)明顯的凋亡，并隨時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡率增加。加藥組與對(duì)照組、聯(lián)合組與單藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。圖1顯示，未加藥對(duì)照組24 h后的早期凋亡率為2.52%，晚期凋亡率為2.71%;A549細(xì)胞加入DCA-Na 75 μg/mL 24 h后的早期凋亡率為13.51%，晚期凋亡率為6.72%;加入DDP 2 μg/mL 24 h后早期凋亡率為16.79%，晚期凋亡率為8.05%;聯(lián)合用藥組早期凋亡率為24.53%，晚期凋亡率為12.14%。

表1 DCA-Na、DDP 單獨(dú)及聯(lián)合作用 A549 細(xì)胞凋亡率(珔x ±s，n=3，%)

圖1 DCA、DDP單獨(dú)及聯(lián)合誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的FCM檢測(cè)結(jié)果

圖2 DCA對(duì)A549細(xì)胞Caspase-3活性的影響

2.5 DCA-Na對(duì) A549細(xì)胞 Caspase-3、8、9 活性的影響 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DCA-Na 37.5、75、150 μg/mL 作用于A549細(xì)胞12 h后，Caspase-3的活力開(kāi)始升高，24 h達(dá)到峰值，之后逐漸下降，72 h內(nèi)一直高于對(duì)照組。各加藥組與對(duì)照組比較，72 h內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。DCA-Na作用于A549細(xì)胞12 h后，Caspase-8的活性開(kāi)始升高，24 h達(dá)到峰值，之后逐漸下降，但直至第72 h仍高于對(duì)照組。各加藥組與對(duì)照組比較72 h內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖 3)。DCA-Na作用于A549細(xì)胞，12 h后Caspase-9的活力開(kāi)始升高，24 h達(dá)到峰值，之后逐漸下降，72 h內(nèi)一直高于對(duì)照組。各加藥組與對(duì)照組比較，72 h內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 DCA對(duì)A549細(xì)胞Caspase-8活性的影響

圖4 DCA對(duì)A549細(xì)胞Caspase-9活性的影響

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，DDP是肺癌化療常用藥物之一，其作用機(jī)制主要是引起DNA損傷，在糖酵解抑制劑的作用下，使ATP生成減少，從而使損傷的DNA無(wú)法復(fù)制，促進(jìn)其化療的作用效果［5］。有研究證實(shí)［6］，DCA能使線(xiàn)粒體去極化并使活性氧及線(xiàn)粒體內(nèi)的凋亡誘導(dǎo)因子流出增多，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物更加敏感。本實(shí)驗(yàn)用MTT法對(duì)檢測(cè)DCA-Na、DDP單獨(dú)及聯(lián)合作用于人肺腺癌A549細(xì)胞株后，結(jié)果顯示，DCA-Na、DDP對(duì)A549細(xì)胞均有抑制作用，但只有選擇合適濃度的DCA與DDP聯(lián)合才有較好的療效。

細(xì)胞凋亡主要通過(guò)Caspase的激活而發(fā)生，其對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的保持十分重要，細(xì)胞凋亡調(diào)控的失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［7］。目前已有研究表明，許多抗腫瘤藥物均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，故誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡己經(jīng)成為腫瘤治療的新思路［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用DCA在體外對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系M059K進(jìn)行抑制試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DCA具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡的作用，其機(jī)制抑制線(xiàn)粒體丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)，從而激活丙酮酸脫氫酶，產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A，后者進(jìn)入線(xiàn)粒體后重啟檸檬酸循環(huán)，促進(jìn)了葡萄糖的氧化磷酸化。同時(shí)，因大量自由基的釋放和膜電位的降低打開(kāi)了線(xiàn)粒體介導(dǎo)的通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且可能與降低Survivin基因表達(dá)并抑制凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中Caspase-3的活性有關(guān)［2］。Wong 等［9］研究證實(shí)，DCA 在體外可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系A(chǔ)N3CA凋亡，并與上游Caspase-9自我催化激活有關(guān)。

Caspase是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要蛋白酶，一旦其被激活，細(xì)胞死亡將不可避免，其激活有死亡受體路徑和線(xiàn)粒體路徑2條途徑［10］。在死亡受體路徑(又稱(chēng)為外源性途徑)中，細(xì)胞膜表面的TNF家族受體接受外源性刺激信號(hào)后，通過(guò)胞質(zhì)中的蛋白網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)至上游的啟動(dòng)子蛋白Caspase-8，激活啟動(dòng)凋亡程序［11］。在線(xiàn)粒體路徑(又稱(chēng)為內(nèi)源性途徑)中，激活Caspase酶是凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，線(xiàn)粒體膜通透性及跨膜電位(△Ψm)的改變使細(xì)胞色素C(Cyt c)釋放到胞漿，與ATP、凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)結(jié)合成復(fù)合物，激活Caspase-9［12］。已有研究證實(shí)［13］，DCA 能激活線(xiàn)粒體途徑的凋亡通路。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分光光度法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的蛋白活性，結(jié)果DCA-Na誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡可能與下游效應(yīng)中的Caspase-3以及上游始動(dòng)中的Caspase-8、Caspase-9蛋白的激活有關(guān)，在DCA-Na誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞株凋亡中，可能外源性和內(nèi)源性?xún)蓷l途徑都有作用。

參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控因素眾多，DCA-Na、DDP單藥及兩藥聯(lián)合可能還存在其他誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑及機(jī)制，尚有待進(jìn)一步的研究。相信隨著研究的不斷深入，DCA抗腫瘤作用的機(jī)制也將逐漸被闡明。

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