HPLC法測定秦嶺柴胡及其不同提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d

衛(wèi) 昊， 劉 清， 衛(wèi)偉光， 崔春利， 張 倩

(1.陜西中醫(yī)學院藥學院，陜西咸陽 712046;2.陜西省西安植物園，陜西西安 710061)

秦嶺柴胡Bupleurum longicauleWall.ex DC.var.giraldiiWolff.又稱金柴胡 (太白)，系傘形科柴胡屬多年生草本植物，與2010年版《中國藥典》一部中收載的柴胡同屬不同種，屬于高山珍稀藥用植物。主產秦嶺太白山、光頭山及佛坪等地，在甘肅天水、武山，青海的民和、玉樹和山西也均有分布。味苦，性微寒，歸肝經。現代藥理研究表明秦嶺柴胡有保肝，解熱，抗菌，抗病毒，消炎，鎮(zhèn)咳，預防消化道潰瘍等作用［1-2］。柴胡屬植物化學成分有三萜皂苷、黃酮類、植物甾醇、香豆精類、木脂類及少量揮發(fā)油［3-4］，其中皂苷類成分中含有量較高的有柴胡皂苷a、c、d。藥理實驗研究表明皂苷a、d具有明顯的藥理活性［5］，目前柴胡皂苷a、d已成為檢驗藥用柴胡質量的標準［6］。因此對柴胡皂苷a、d進行定量分析，可作為評價秦嶺柴胡生藥質量的重要依據。然而，現有文獻中，關于HPLC法測定柴胡皂苷a的報道較多，但未見有對秦嶺柴胡中柴胡皂苷a、d同時進行定量測定的報道。故本研究采用HPLC法，選擇合適的色譜條件同時對生長在東、西太白山上的秦嶺柴胡中柴胡皂苷a、d進行定量測定研究，以期為今后秦嶺柴胡的開發(fā)和應用提供一定的實驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters 2996DAD，Empower色譜工作站，BT25s(十萬分之一)電子天平 (北京賽多利斯儀器有限公司)，LD—4型高速中藥粉碎機 (浙江省溫嶺市大海藥材器械廠)，CQ—250型超聲清洗器 (上海超聲儀器廠)。

1.2 試藥 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品 (中國藥品生物制品檢定所，供定量測定用，批號依次為:110777-200507、110778-200505)。秦嶺柴胡:1號藥材樣品采自東太白山 (陜西眉縣)海拔3 400～3 500 m處;2號藥材樣品采自西太白山(陜西太白縣)海拔3 400 m左右處。均經陜西中醫(yī)學院王繼濤高級實驗師鑒定為傘形科植物秦嶺柴胡Bupleurum longicauleWall.ex DC.var.giraldiiWolff的全草。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-水 (25∶75);體積流量1.0 mL/min;檢測波長210 nm;柱溫29℃;進樣量10 μL。

2.2 柴胡皂苷a、d對照品溶液的制備 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷a 1.075 mg、含柴胡皂苷d 0.072 mg的對照品溶液，搖勻，即得。

2.3 秦嶺柴胡不同溶劑提取液的制備 取秦嶺柴胡1號、2號樣品各約250 g，精密稱定，分別加水煎煮2次，每次2 h，過濾，合并濾液，加熱濃縮，分別定容于250 mL量瓶中;另取秦嶺柴胡1號、2號樣品各約250 g，精密稱定，分別以65%乙醇及95%乙醇為溶劑加熱回流2次，過濾，合并濾液，回收乙醇至無醇味，濃縮定容至250mL量瓶中。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 秦嶺柴胡藥材供試品溶液的制備 取秦嶺柴胡1號、2號樣品粉末 (過四號篩)各約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得，臨用前過0.45 μm濾膜，作為進樣溶液［7］。

2.4.2 秦嶺柴胡不同溶劑提取供試品溶液的制備精密吸取2.3項下秦嶺柴胡1號、2號樣品水提取濃縮液5 mL，65%乙醇提取濃縮液2 mL，95%乙醇提取濃縮液4 mL，置于分液漏斗中，以乙醚脫脂3次，每次20 mL，并以水飽和正丁醇萃取3次，每次30 mL，再以正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，將得到的上層液在蒸發(fā)皿中水浴揮干正丁醇，再以甲醇溶解并將經上述處理的水提取物定容至2 mL量瓶，65%乙醇、95%乙醇提取物均定容至5 mL量瓶，搖勻，均以0.45 μm的微孔濾膜過濾，作為供試品溶液［8-11］。

2.5 系統適用性試驗 精密吸取柴胡皂苷a對照品溶液、柴胡皂苷d對照品溶液、東太白秦嶺柴胡65%乙醇提取液制得的供試品溶液，注入HPLC色譜儀，色譜圖見圖1，在選定的色譜條件下柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的理論塔板數均不少于6 000，與其他峰的分離度均大于1.5。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.6 方法學考察

2.6.1 標準曲線的制備 精密吸取2.2項下的柴胡皂苷a對照品溶液和柴胡皂苷d對照品溶液各2、4、8、12、16、20、25 μL注入高效液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 標準曲線Tab.1 Standard curve

2.6.2 精密度試驗 精密吸取1.075 mg/mL的柴胡皂苷a對照品溶液和0.072 mg/mL的柴胡皂苷d對照品溶液，按同樣色譜條件進行HPLC分析，各連續(xù)進樣5次，每次10 μL，計算峰面積，RSD分別為1.6%和0.62%，表明本法精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取秦嶺柴胡1號樣品65%乙醇提取物的供試品10 μL，在0、4、8 h分別進樣分析，記錄色譜峰面積，結果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積的RSD值分別為0.08%和1.58%。結果表明，供試品在本實驗條件下穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復性試驗 取秦嶺柴胡藥材1號樣品粉末5份，每份約2 g，按2.3項和2.4.2項65%乙醇回流提取方法制備，并進樣分析，記錄色譜峰面積，結果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積的RSD值分別為1.59%和1.00%。結果表明，本方法重復性較好。

2.6.5 加樣回收率試驗 取柴胡皂苷a(1.075 mg/mL)對照品溶液5.3 mL、柴胡皂苷d(0.072 mg/mL)對照品溶液7 mL加入秦嶺柴胡藥材1號樣品粉末中，按2.3項和2.4.2項65%乙醇回流提取方法制備的供試品溶液分別于10 mL量瓶，混合均勻，定容至刻度，然后進行HPLC分析，結果柴胡皂苷 a的平均回收率為98.31%，RSD為1.04%;柴胡皂苷d的平均回收率為97.00%，RSD為1.12%。結果見表2和表3。

表2 柴胡皂苷a回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests of saikosaponin a

表3 柴胡皂苷d回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery tests of saikosaponin d

2.7 東西太白秦嶺柴胡比較 分別取秦嶺柴胡1號、2號樣品藥材，按2.3項下方法制備 (2號樣品即西太白秦嶺柴胡定容于2 mL量瓶中)，精密吸取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定，計算柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的量，結果見表4和5。

表4 藥材供試品溶液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d測定結果Tab.4 Determination results of saikosaponin a and saikosaponin d in samples of different extracts

表5 不同提取部位柴胡皂苷a和柴胡皂苷d測定結果Tab.5 Determination results of saikosaponin a and saikosaponin d in samples of different extracted parts

3 討論

柴胡皂苷a和柴胡皂苷d結構中的環(huán)氧結構在高溫或酸性條件下易開環(huán)，轉化成柴胡皂苷b1和b2，因此提取條件需要加以注意，最好在堿性條件下低溫提取，因此制定了2.4.1項下的藥材供試品溶液制備方案。而在工業(yè)生產中，提取溶媒通常為水和乙醇，所以本實驗在供試樣品制備中采用2.3項下的提取方案。柴胡皂苷結構見圖2。

一般采用50%～70%乙醇提取中等極性的成分，85%～95%乙醇提極性較小成分，本實驗采用水、65%乙醇和95%乙醇來提取藥材，是為了后續(xù)進一步進行其藥效學評價和量效關系而設計的提取方案。從表5中可以看出，65%乙醇提取物中柴胡皂苷a和d的含有量高于水和95%乙醇提取物中的柴胡皂苷a和d。由于柴胡皂苷在含水丁醇或戊醇中溶解度較好［12］，因此本實驗將正丁醇作為萃取柴胡皂苷的溶劑。

圖2 柴胡皂苷結構Fig.2 Structures of saikosaponins

在2.7項下進行西太白秦嶺柴胡中柴胡皂苷d測定時，由于在擬定的供試品制備條件下峰面積太小，低于線性范圍的下限，因此，將其最終定容體積確定為2 mL，使得測定的峰面積處于線性范圍內，保證了測定結果的準確性。

本實驗采用HPLC法對不同生長區(qū)域的秦嶺柴胡及其不同溶劑提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d進行了測定，其分析方法簡便可行。但柴胡皂苷d峰面積小，含有量低，其中，以秦嶺柴胡2號樣品65%乙醇提取物，秦嶺柴胡1號樣品95%乙醇提取物中柴胡皂苷d峰型最小，經計算S/N(信噪比)小于10，峰面積不可靠，不能有效計算其量。表5結果表明:不同溶劑系統的提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷a、d之和的差異較大，不能單用柴胡皂苷a的含有量來評價柴胡的質量，最好兩者兼顧。另外，本實驗通過對兩種產地的秦嶺柴胡不同提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的測定，也為下一步開展藥理作用中量效關系研究提供了一定的實驗依據。

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