中國(guó)南海多棘海星水提物抗皮膚真菌的活性分析

華 影，唐曉磊，陳章權(quán)，于靜蕊

1遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430071；3廣東醫(yī)學(xué)院廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；4遼寧錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州 121001；5阜陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽阜陽(yáng) 236031

海星(sea star)是常見的海洋生物之一。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)多種海星活性物質(zhì)，如皂苷、甾醇、蒽醌、多糖、多肽、糖脂等，具有抗腫瘤、抗感染、抗心管病等作用[1-5]。課題組此前曾報(bào)道過(guò)南海多棘海星的提取物在NKT細(xì)胞激活以及抗腫瘤方面的研究工作[6-7]。國(guó)內(nèi)對(duì)海星抗真菌的研究?jī)H見膠州灣羅氏海星皂苷類物質(zhì)抗酵母真菌的報(bào)道[8]，而海星抗皮膚真菌卻鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)做了對(duì)我國(guó)南海多棘海星提取物抗皮膚真菌的研究，報(bào)告如下。

材料和方法

1 材料 多棘海星(asteruzs rollestoni)采自中國(guó)湛江海域，由海南大學(xué)海洋學(xué)院方再光博士鑒定。紅色毛癬菌(tricophyton rubrum)5株，斷發(fā)毛癬菌(trichophyton tonsurans)和石膏樣小孢子菌(microsprum gypseum)各3株，由遼寧錦州市中心醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；冷凍干燥機(jī)77520-01 Freezone b購(gòu)自美國(guó)(Labconco公司)；Milli-Q超純水機(jī)；貝克曼-庫(kù)爾特波長(zhǎng)掃描儀；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)；Bio-Rad TC-10細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；Eppendorf培養(yǎng)箱；Agilent 1260型高效液相柱層析(HPLC)儀，Agilent ZORBAX GF-250型葡聚糖凝膠色譜柱(9.4 mm×250 mm，4 μm)和ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)均為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，HPLC層析柱洗脫流動(dòng)相所用甲醇、乙腈為色譜純，氟康唑(fluconazole)常州市第二制藥廠，批號(hào)930805。其余試劑均為國(guó)藥集團(tuán)分析純。

2 海星水溶性成分的制備 取新鮮南海多棘海星，經(jīng)粉碎、冷凍干燥、除脂等處理[6-7]，加入2倍體積的去離子水，于4 ℃環(huán)境中連續(xù)攪拌24 h，400目紗布過(guò)濾后收集海星水提液，10 000 g離心10 min，將水相提取液pH調(diào)整為7.4，并于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3 海星水提物特征吸收波長(zhǎng)的確定 將提取的儲(chǔ)存液配制成3個(gè)濃度梯度，并以貝克曼波長(zhǎng)掃描儀從190~900 nm進(jìn)行連續(xù)掃描，對(duì)海星水提物中在某特定波長(zhǎng)處有吸收峰的波長(zhǎng)作為后續(xù)分離的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 高效液相色譜法(HPLC)對(duì)水提物的分離 將水提物經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀(HPLC)連以葡聚糖凝膠柱ZORBAX GF-250分離手段進(jìn)行初步分離，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃，流速為1 ml/min，在213 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。隨后利用高效液相色譜儀(HPLC)連以C18硅膠柱對(duì)首次分離的有效組分進(jìn)一步分離。在ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱中以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動(dòng)相，調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃，流速為1 ml/min，在213 nm處進(jìn)行檢測(cè)。

5 抗真菌的活性檢測(cè) 配制新鮮產(chǎn)孢子液體培養(yǎng)基：含L-谷酰胺而不含重碳酸鹽的RPMI1640培養(yǎng)基，使用0.165 mol/L 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸調(diào)至pH 7.0，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。初次分離的冷凍干燥后，稱取并用新鮮的液體培養(yǎng)基調(diào)至0.1 mg/ml備用。將26 ℃培養(yǎng)10 d后的PDA培養(yǎng)基中注入含0.05%吐溫-80 ℃的0.9%氯化鈉無(wú)菌溶液，適度震蕩并用無(wú)菌玻棒摩擦菌落表面，用200目濾網(wǎng)除去菌絲，用Bio-Rad細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，最終以配制的含有不同分離組分的液體培養(yǎng)基調(diào)孢子濃度至105/ml備用。設(shè)置空白對(duì)照(僅含有培養(yǎng)基)、氟康唑陽(yáng)性對(duì)照組(氟康唑用少許二甲基亞砜助溶終濃度為10 μg/ml)、陰性對(duì)照和各提取組分實(shí)驗(yàn)組，每組同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于30 ℃，濕度80%~90% RH的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h后，重新計(jì)數(shù)各培養(yǎng)孔中的孢子濃度。并計(jì)算孢子生長(zhǎng)率：(提取物實(shí)驗(yàn)組待測(cè)孔讀數(shù)－空白孔孢子讀數(shù)/陰性孔讀數(shù)-空白孔讀數(shù))×100%。在隨后對(duì)初次分離第3組分(FSF-3)抑制紅色毛癬菌的檢測(cè)中，用新鮮液體培養(yǎng)基將初次分離第3組分配制成終濃度分別為100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、12.5 μg/ml、6.25 μg/ml、3.12 μg/ml、1.56 μg/ml、0.78 μg/ml、0.39 μg/ml， 其 余 組 別設(shè)置及操作同上。FSF-3經(jīng)高效液相色譜連以C18硅膠柱分離各組分冷凍干燥后，稱量各組分并以新鮮液體培養(yǎng)基(上述)調(diào)至10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml進(jìn)行抗菌檢測(cè)。其余組別設(shè)置及操作同上。

結(jié) 果

1 海星水提取物的波長(zhǎng)掃描圖譜 將水提物配制成1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.1 mg/ml 3個(gè)濃度，在190~900 nm每間隔1nm進(jìn)行連續(xù)掃描，測(cè)得各波長(zhǎng)的吸光度值，發(fā)現(xiàn)在213 nm處有峰值，見圖1。

2 海星水提取物經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離圖譜 在葡聚糖凝膠柱中以pH 7.4的磷酸鹽為流動(dòng)相，調(diào)節(jié)柱溫箱為23 ℃，調(diào)節(jié)流速至1 ml/min，在213 nm處檢測(cè)，對(duì)海星水提取物各分離組分的響應(yīng)度所繪制的峰圖，根據(jù)分離程度結(jié)合實(shí)驗(yàn)需要分為5組主要成分，分別標(biāo)記為FSF-1、FSF-2、FSF-3、FSF-4、FSF-5，見圖 2。

3 葡聚糖凝膠柱分離所得各組分抗真菌活性鑒定使用微孔稀釋法通過(guò)對(duì)96 h培養(yǎng)后各孔孢子濃度的測(cè)定，在同一菌種的藥物敏感性檢測(cè)中以(待測(cè)孔讀數(shù)－空白孔孢子讀數(shù)/陰性孔讀數(shù)-空白孔讀數(shù))×100%表示其孢子生長(zhǎng)率(表1)，以及FSF-3組分抑制紅色毛癬菌的劑量依賴性的檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著FSF-3濃度的降低抑菌效果逐漸減弱，當(dāng)濃度低于0.78 μg/ml則無(wú)明顯抑菌效果，見圖3。

4 FSF-3組分分離圖譜 以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動(dòng)相，并以流動(dòng)相溶解FSF-3至濃度為1 mg/ml，調(diào)節(jié)柱溫箱為23℃，調(diào)節(jié)流速至1 ml/min，通過(guò)C18硅膠柱按照極性差異，在213 nm處進(jìn)行分離。根據(jù)分離情況分為3個(gè)主要組分，分別標(biāo)記為SSF-1、SSF-2、SSF-3，見圖4。

5 FSF-3再次分離所得各組分抗真菌活性鑒定微量稀釋法檢測(cè)不同濃度SSF-1、SSF-2、SSF-3組分對(duì)紅色毛癬菌的抑制作用，見表2。

圖1 三種濃度海星水提取物的波長(zhǎng)掃描Fig.1 Wavelength scan of water-soluble extracts from Asteruzs rollestoni at 3 different concentrations

圖2 海星水提取物在葡聚糖凝膠分離柱中的色譜圖FSF1-FSF5： 第一分離組分至第五分離組分Fig.2 Chromatogram of water-soluble extract from Asteruzs rollestoni by sephadex column FSF1-FSF5: The first separated fractions 1-5

圖3 不同濃度海星水提物組分FSF-3對(duì)紅色毛癬菌孢子生長(zhǎng)率的影響Fig.3 Effect of FSF-3 at different concentrations separated from Asteruzs rollestoni on growth rate of Tricophyton rubrum spore

圖4 海星水提物FSF-3組分經(jīng)C18硅膠分離柱分離組分的色譜圖Fig.4 Chromatogram of FSF-3 separated by combined HPLC and C18 silicagel column SSF-1-3: secondary separated fractions 1-3

表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對(duì)三種真菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對(duì)三種真菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

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表2 FSF-3經(jīng)C18硅膠分離柱分離所得三個(gè)組分對(duì)紅色毛癬菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

表2 FSF-3經(jīng)C18硅膠分離柱分離所得三個(gè)組分對(duì)紅色毛癬菌孢子生長(zhǎng)率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

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討 論

皮膚癬菌引起的淺部真菌感染一直是皮膚科臨床最常見的皮膚病[9]。目前臨床上使用的各種合成抗真菌藥物在一定程度上可以控制真菌的感染，然而其對(duì)人體均有一定的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)中國(guó)南海海域的多棘海星其體內(nèi)水溶性物質(zhì)的抗真菌活性展開研究，對(duì)海星水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離并與常見的3種皮膚癬菌共培養(yǎng)進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，旨在從中篩選出具有抗菌活性的成分。

本研究在對(duì)提取物各組分的抑菌活性檢測(cè)中使用了微量稀釋法，該方法優(yōu)點(diǎn)是用藥量少，操作易標(biāo)準(zhǔn)化及可借助儀器判讀結(jié)果等。該技術(shù)已被推薦用于酵母菌的MIC測(cè)定，室間質(zhì)控結(jié)果證明效果滿意[10]。中國(guó)醫(yī)科院皮膚病研究所于1997年首次報(bào)道了微量稀釋法在測(cè)定皮膚癬菌最低抑菌濃度的實(shí)驗(yàn)研究[11]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，此液體培養(yǎng)基的應(yīng)用可有效的產(chǎn)生豐富的真菌孢子而只有極少量的菌絲以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

本文先將海星水溶性成分通過(guò)葡聚糖凝膠柱，根據(jù)分子量大小進(jìn)行初次分離。將初次分離的組分與3種真菌共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，在初次分離的FSF-3組分中含有對(duì)紅色毛癬菌有較強(qiáng)抑菌作用的物質(zhì)。紅色毛癬菌是臨床常見的皮膚癬菌，皮膚淺部真菌病60%以上是由紅色毛癬菌感染所致[9,12]。遂將FSF-3組分作為重點(diǎn)研究對(duì)象，追蹤具有抑菌活性的成分。對(duì)FSF-3的分離中使用了HPLC連接C18硅膠柱根據(jù)極性差異進(jìn)行再次分離，經(jīng)過(guò)物質(zhì)分子量和極性的兩次分離，這樣保證了物質(zhì)成分較為單純。對(duì)各分離組分的抑菌活性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SF-3組分的MIC(middle inhibitor concentration)可達(dá)3.15 μg/ml，與同類提取物對(duì)紅色毛癬菌的抑菌濃度報(bào)道相比，其濃度顯著低于報(bào)道值[13-14]。而對(duì)FSF-3的進(jìn)一步分離檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SSF-1組分對(duì)紅色毛癬菌的抑菌活性不明顯，而SSF-2及SSF-3對(duì)紅色毛癬菌均有一定的抑菌效果。推測(cè)SSF-2和SSF-3中可能存在著分子量大小接近而極性卻差異較為明顯的物質(zhì)。然而對(duì)該活性組分的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等信息仍需進(jìn)一步的鑒定，并擬在動(dòng)物水平上驗(yàn)證其抗菌活性。上述研究為研制新型的海洋抗真菌藥物提供了方向和切入點(diǎn)。

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