臨床細菌多重耐藥機制研究進展及對策

董 梅 綜述 匡鐵吉 審校

解放軍第309醫(yī)院 檢驗科，北京 100091

［組稿專家簡介］ 董梅，解放軍第309醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心主任，主任醫(yī)師，碩士生導師?，F(xiàn)任全軍檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會委員、全軍檢驗醫(yī)學專業(yè)免疫分委會副主任委員、總參血液管理學專業(yè)委員會主任委員、總參基礎醫(yī)學與檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會副主任委員。近5年承擔國家自然科學基金課題、國家“十一五”科技支撐計劃子課題、國家重大傳染病專項等多項課題，從事細菌耐藥和免疫學研究10余年，獲軍隊科技進步三等獎3項、中華科技進步三等獎1項，華夏科技二等獎1項。發(fā)表論文40余篇， SCI 5篇，主編專著2部。

隨著抗生素的大量應用，特別是無指征用藥、不恰當?shù)剡x擇備用抗菌藥、過度治療及頻繁換藥，導致耐藥率越來越高，耐藥程度越來越嚴重[1]。自發(fā)耐藥突變的存在與抗生素選擇壓力的持續(xù)作用，病原菌環(huán)境適應能力與人體微環(huán)境生態(tài)變化的進化催動，是臨床耐藥菌和多重耐藥菌產(chǎn)生的基礎。多重耐藥菌，廣義上也包括廣泛耐藥菌或超級細菌，其產(chǎn)生和發(fā)展給臨床診治帶來巨大挑戰(zhàn)。研究多重耐藥菌的耐藥機制，有利于發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點，對研究抗菌新藥，對臨床制定合理的治療方案，對制定多重耐藥菌感染與傳播預防策略有重要意義。

1 臨床常見多耐藥機制

1.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)產(chǎn)生菌 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶： 產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因，β-內(nèi)酰胺酶通過絲氨酸活性位點與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物分子中酰胺環(huán)結合并打開β-內(nèi)酰胺環(huán)，導致藥物失活。驅(qū)動ESBLs進化的選擇壓力通常歸因于β-內(nèi)酰胺類、奎諾酮類等藥物的使用強度，β-內(nèi)酰胺類藥物可促使ESBLs基因拷貝數(shù)增加而導致細菌高產(chǎn)ESBLs，同種屬和不同種屬的細菌通過接合、傳導、轉化、轉座等方式獲得耐藥基因，導致更多細菌產(chǎn)生ESBLs。已發(fā)現(xiàn)ESBLs超過300余種，根據(jù)編碼基因同源性的不同分為TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA和其他5類。國內(nèi)以CTX-M型為主，產(chǎn)ESBLs細菌的耐藥基因質(zhì)粒不僅可以通過垂直傳播，而且可以水平傳播，通過多種耐藥基因在細菌的質(zhì)粒上群聚，致使細菌產(chǎn)生多重耐藥性[2-3]。一般ESBLs由臨床占首位的腸桿菌科細菌產(chǎn)生，其中以大腸桿菌為主，其次為肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌等，ESBLs的產(chǎn)生使抗感染治療更為困難，抗菌藥物選擇更窄。

1.2 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA) 金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界，醫(yī)院醫(yī)師和護士鼻腔帶菌達到80%~100%，而且常為耐藥菌，是醫(yī)院感染的重要因素。MRSA定義為攜帶mecA基因或表達青霉素結合蛋白2a(penicillin-binding protein 2a，PBP2a)，通常呈多重耐藥菌(multidrug resistance bacteria，MDR)，對氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類耐藥。MRSA主要耐藥機制有兩種： 1)由于染色體DNA介導的固有耐藥性，主要是由于MRSA存在mecA基因，其編碼產(chǎn)生一種特殊的青霉素結合蛋白(PBP2a)，對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力降低而產(chǎn)生耐藥性； 2)由于質(zhì)粒介導產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而獲得耐藥、來源為DNA的轉導、轉化或其他類型的DNA插入，β-內(nèi)酰胺酶可使β-內(nèi)酰胺類抗生素失去活性，從而導致耐藥[4]。

1.3 耐萬古霉素的腸球菌(vancomycin resistant enterococci，VRE) 耐萬古霉素的腸球菌通過改變五肽聚糖前體而使萬古霉素不能與改變了的肽聚糖交聯(lián)靶位點(D-Ala-D-lactate)結合，從而阻止了萬古霉素對細胞壁合成的抑制，肽聚糖交聯(lián)靶位點改變導致萬古霉素耐藥。臨床上的VRE常引起嚴重感染，治療極為困難。腸球菌耐藥愈來愈廣，表現(xiàn)為高水平的耐青霉素、耐氨基糖甙類和耐萬古霉素，以及對頭孢菌素、克林霉素、磺胺天然耐藥。目前，由于質(zhì)粒、轉座子及突變株的產(chǎn)生，腸球菌又對四環(huán)素、氯霉素、奎諾酮產(chǎn)生耐藥性。其耐藥機制是耐藥基因播散，細菌獲得耐藥基因，細菌細胞壁上的D-丙氨酸-D-丙氨酸二肽被D-丙氨酸-D-賴氨酸或D-丙氨酸-D-色氨酸取代，與萬古霉素的親和力降低表現(xiàn)為耐藥[5-6]。腸球菌屬可通過宿主質(zhì)粒在腸球菌和其他G+球菌(如金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬)之間轉移耐藥基因，存在將萬古霉素的耐藥性傳遞給毒力更強的細菌的危險。

1.4 耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(包括NDM-1基因攜帶菌)碳青霉烯酶是指所有明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類的一類β-內(nèi)酰胺酶，分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶。其中A類酶為絲氨酸酶，見于一些腸桿菌科細菌； B類為金屬酶，由染色體、質(zhì)?；蜣D座子介導，產(chǎn)金屬酶的細菌包括鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌科細菌。帶有NDM-1基因的細菌，能水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(如青霉素G、氨芐西林、甲氧西林、頭孢類等抗生素)，因而對這些廣譜抗生素具有耐藥性[7]。發(fā)現(xiàn)帶有NDM-1的細菌主要為大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、摩氏摩根菌、鮑曼不動桿菌、屎腸球菌等[8-9]。帶有NDM-1基因的細菌對臨床常用的大多數(shù)抗生素都耐藥，如： 亞胺培南、美羅培南、氧哌嗪青霉素-他唑巴坦、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢匹羅、氨曲南、環(huán)丙沙星、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米諾四環(huán)素等。由于產(chǎn)金屬酶的細菌均具有廣泛耐藥性，已成為臨床抗感染治療、特別是革蘭氏陰性菌感染治療的難點，也是細菌耐藥與傳播機制研究的挑戰(zhàn)[10]。

細菌的能量依賴性主動轉運機制，能將已經(jīng)進入細菌體內(nèi)的抗生素泵出體外； 降低抗生素吸收速率或改變了轉運途徑，也導致耐藥性的產(chǎn)生[11]。RND家族、MFS超家族和APC超家族是目前細菌膜外排泵系統(tǒng)的主要研究熱點[12]。此外，靶位蛋白的改變、外膜孔蛋白的缺失與改變、產(chǎn)生修飾酶，均與細菌耐藥性有關。

1.5 多重耐藥結核分枝桿菌(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB) 近年來不斷上升的耐多藥結核病人，為結核病的控制工作帶來嚴峻挑戰(zhàn)，據(jù)WHO估計每年全球被MDR結核菌感染的肺結核患者至少50萬。MDR是指至少對利福平和異煙肼兩種主要抗結核藥物耐藥的結核菌。與普通結核病相比，針對MDR-TB的治療需要引入二線抗結核藥物，治療成本大幅提高，時間更長，并且產(chǎn)生更多的不良反應。其耐藥機制主要是基因突變，多數(shù)學者認為因結核分枝桿菌不存在質(zhì)粒，無法通過質(zhì)粒介導而獲得耐藥性，因此染色體介導產(chǎn)生的耐藥性是MDR-TB產(chǎn)生耐藥的主要基礎，如： 乙胺丁醇耐藥與embB基因突變有關，利福平耐藥與rpoB基因突變有關。結核桿菌耐異煙肼的機制比較復雜，是通過katG基因突變導致菌體內(nèi)過氧化氫酶-過氧化物酶活性降低或缺失，該基因是過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因，這可以解釋90%以上異煙肼的耐藥。katG的完全缺失主要出現(xiàn)在高度耐異煙肼株。katG的隨機突變最常見的位點是315位密碼子，該位置的變異通過對katG活性位點甲基化阻礙了異煙肼與katG的結合，導致酶失去活化異煙肼的能力，inhA基因突變是異煙肼另一分子機制。而鏈霉素耐藥與rpsL有關，多重耐藥結核菌多由多種藥物選擇突變靶基因有關[13-14]。

2 應對多重耐藥菌的對策

2.1 合理用藥與耐藥性監(jiān)測 無論是質(zhì)?；蛉旧w介導的耐藥性，一般只發(fā)生在少數(shù)細菌內(nèi)，只有當占優(yōu)勢的敏感菌因抗感染藥物的選擇性作用被大量消滅后，耐藥菌才得以繁殖并導致感染，因此，細菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展是抗感染藥物廣泛應用，特別是無指征濫用的結果[15]。合理用藥可以治病； 反之，特別是抗菌藥物濫用，將導致細菌耐藥性產(chǎn)生與耐藥菌感染流行，還會發(fā)生不良反應和藥源性疾病。合理應用抗菌藥物是預防延緩細菌耐藥性產(chǎn)生的重要手段，而細菌耐藥監(jiān)測可為合理應用抗菌藥物提供依據(jù)。在耐藥監(jiān)測中，細菌耐藥性的產(chǎn)生與抗菌藥物應用關系的研究，可謂重中之重。由于細菌耐藥監(jiān)測意義重大，全球各國都建立有自己相應的細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡，這些細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)為促進各國抗菌藥物合理使用發(fā)揮了積極作用[16]。

2.2 開發(fā)新藥與快速藥敏試驗 耐藥菌，特別是多重耐藥和廣泛耐藥病原菌日趨嚴重的流行狀況，極大地壓縮了臨床抗感染藥物的選擇空間，臨床診治難度加大，還增加了多重耐藥菌傳播、流行和產(chǎn)生新耐藥變異的機會。開發(fā)高效抗菌新藥是戰(zhàn)勝多重耐藥菌感染的最有效手段，已受到廣泛關注和重視[17-18]。多重耐藥菌對藥物的抗性往往涉及多種耐藥機制的協(xié)同作用，針對不同耐藥機制靶標和全細胞代謝調(diào)控設計和開發(fā)抗菌新藥，隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展、蛋白質(zhì)組學和生物信息學的進步與融合，將帶來新的機遇和挑戰(zhàn)，并顯示巨大發(fā)展?jié)摿19-21]。盡管抗菌新藥在不斷開發(fā)出來并投入應用，但病原菌耐藥情勢依然嚴峻，這表明合理用藥才是不變的主題。

與新藥開發(fā)同樣緊急的任務是研制準確快速的藥物敏感試驗方法，只有盡快獲得感染菌敏感藥物譜，臨床醫(yī)生才有可能真正做到合理用藥。病原菌分離培養(yǎng)、涂片鏡檢、菌種鑒定與耐藥性檢測是相互關聯(lián)的環(huán)節(jié)，每一級環(huán)節(jié)上的結果都在不同層次上為臨床醫(yī)生提供了合理用藥的有效依據(jù)。在微生物實驗室，落實分級檢驗結果及時報告制度，為臨床合理用藥贏得了時間。采用分子生物學技術快速鑒定病原菌和檢測耐藥基因，已取得了長足的進步并得到初步應用。例如，通常獲得結核菌藥物敏感試驗結果需要2個月或更長時間，而通過檢測痰標本結核菌利福平耐藥基因rpoB診斷MDR只需要4 d，而且靈敏度達91%，特異性達98%[22-24]。

另外，降鈣素原(procalcitonin，PCT)監(jiān)測濃度結果用于指導抗感染治療，可明顯縮短感染病人抗生素使用時間[25-27]；對傳染性強、傳播范圍廣的呼吸道感染病毒開展檢測，將有利于防止濫用抗生素； 實現(xiàn)真菌藥敏試驗方法的標準化，將提升真菌耐藥性檢測質(zhì)量[28]。以上諸項，就是目前應對臨床多重耐藥菌的主要措施。

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