甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)及技術(shù)簡(jiǎn)化研究

李書宇，陳倫林，鄒小云，鄒曉芬，張建模，熊 潔，彭小松，宋來(lái)強(qiáng)*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所/油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330200;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045)

小孢子培養(yǎng)是指將植物的小孢子直接從花藥中分離出來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)成胚，進(jìn)而發(fā)育成完整植株的一種技術(shù)。該技術(shù)可廣泛應(yīng)用于雜優(yōu)親本培育、常規(guī)育種、遺傳群體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因等研究[1]。1982年Lichter[2]首次通過(guò)甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)獲得再生植株后，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)影響甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)的諸多因素進(jìn)行了廣泛的研究[3－6]，小孢子胚的再生頻率有了很大提高。盡管近年來(lái)油菜小孢子培養(yǎng)體系不斷完善，但該技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中仍存在以下問(wèn)題:甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)供體材料大多植于大田，受基因型和環(huán)境影響較大，小孢子培養(yǎng)胚誘導(dǎo)頻率總體偏低，且油菜花期相對(duì)集中，按照小孢子胚誘導(dǎo)及生長(zhǎng)發(fā)育的速度，當(dāng)觀察到無(wú)法獲得胚狀體時(shí)，很可能已錯(cuò)過(guò)花期，無(wú)法再重新取樣培養(yǎng)。

本試驗(yàn)對(duì)影響小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生的因素進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)體系，提高胚狀體的發(fā)生頻率;對(duì)甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)配方進(jìn)行簡(jiǎn)化，研究熱擊培養(yǎng)1d后倒置顯微鏡下小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)與最終產(chǎn)胚率的關(guān)系，建立快速評(píng)估最終產(chǎn)胚率的參考指標(biāo)，在有限花期內(nèi)提高工作效率。通過(guò)以上研究，進(jìn)一步優(yōu)化培育技術(shù)、簡(jiǎn)化操作環(huán)節(jié)，提高工作效率，對(duì)于小孢子培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于育種實(shí)踐具有較大意義。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用64份甘藍(lán)型油菜于2010、2011年秋季種植在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，露地栽培，常規(guī)管理。在次年2、3月份油菜花期，分別取各材料的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

2011年:0L001，0L002，0L003，0L004，0L005，0L006，0L007，0L008，0L011，0L012，0L013，0L014，0L017，0L018，0L025，0L028，0L029，0L030，0L032，03161，03183，03196，03203，03207，03243，03250，03255，03297，01479，OC1200，AM052，88267，99B01，湘雜油 1613。

2012年:11075，11123，11140，11456，11471，11561，11568，11571，11573，11575，11576，11577，1L001，1L009，1L010，1L011，1L012，1L014，1L015，1L022，1L023，1L025，1L026，1L027，1L032，1L033，1L034，1L039，1L041，1L044。

以上所用材料除湘雜油1613由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供以外，均為江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所的育種后代材料。其中，1L002、1L014、1L023、1L027用于低溫預(yù)處理對(duì)產(chǎn)胚率影響的研究，0L003、0L013、0L028用于簡(jiǎn)化小孢子分離洗液配方的研究。

1.2 方法

1.2.1 小孢子胚狀體的誘導(dǎo) 在油菜初花期從田間選取生長(zhǎng)健壯的植株，從主花序或一次分枝花序上選取3 mm左右大小的花蕾，用84消毒液滅菌15 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次，置于離心管中加適量B5－13%蔗糖溶液(蔗糖濃度為13%的B5液體培養(yǎng)基)磨碎，經(jīng)雙層尼龍網(wǎng)過(guò)濾到離心管中，1 100 r/min離心4 min，重復(fù)2次，將小孢子懸浮于NLN－13液體培養(yǎng)基(含50 mg/L秋水仙素)并分裝在培養(yǎng)皿中(密度約1個(gè)花蕾/mL)，置于32℃黑暗條件下熱擊培養(yǎng)2 d。之后再離心，重新收集小孢子，懸浮于不含秋水仙素的NLN－13液體培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)至肉眼可見的胚狀體。隨后移至50 r/min、25℃恒溫?fù)u床上繼續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)直至形成子葉形胚狀體。

1.2.2 低溫預(yù)處理對(duì)產(chǎn)胚率的影響 在初花期選取主花序和上部一次分枝花序，置4℃冰箱中低溫冷藏0 h，6 h，24 h，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d 后，分離培養(yǎng)小孢子。調(diào)查產(chǎn)胚率，以低溫處理0 h 為對(duì)照。比較不同低溫處理時(shí)間對(duì)小孢子培養(yǎng)產(chǎn)胚率的影響。產(chǎn)胚率是指通過(guò)小孢子培養(yǎng)獲得的胚的數(shù)量與所用的花蕾個(gè)數(shù)的比值，下同。

1.2.3 簡(jiǎn)化小孢子分離洗液配方 在搗碎花蕾、離心收集小孢子的過(guò)程中，分別使用兩種分離培養(yǎng)液:B5－13%蔗糖溶液(蔗糖濃度為13%的B5液體培養(yǎng)基)和13%蔗糖溶液，重復(fù)2次，分析不同分離培養(yǎng)液處理下產(chǎn)胚率的差異。

1.2.4 分離培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡下小孢子培養(yǎng)反應(yīng)與產(chǎn)胚的關(guān)系 32℃黑暗條件下熱擊培養(yǎng)1 d后，將裝有小孢子的培養(yǎng)皿取出，在倒置顯微鏡下觀察小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)。根據(jù)倒置顯微鏡下觀察到的情況，將小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)分為3個(gè)等級(jí):好、一般和無(wú)培養(yǎng)反應(yīng)。培養(yǎng)反應(yīng)好:在任意一個(gè)視野中都可以看得大量小孢子發(fā)生明顯的體積膨大。培養(yǎng)反應(yīng)一般:可以觀察到有小孢子發(fā)生明顯的體積膨大，但數(shù)量不多。無(wú)培養(yǎng)反應(yīng):沒(méi)有觀察到小孢子發(fā)生明顯的體積膨大。之后將培養(yǎng)皿放回32℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，1 d后重新收集小孢子，懸浮于不含秋水仙素的NLN－13液體培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)至肉眼可見的胚狀體。隨后移至50 r/min、25℃恒溫?fù)u床上繼續(xù)進(jìn)行暗培養(yǎng)直至形成子葉形胚狀體。統(tǒng)計(jì)各個(gè)材料的產(chǎn)胚率，并分析倒置顯微鏡下小孢子培養(yǎng)反應(yīng)與產(chǎn)胚的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型材料出胚的差異

在2011—2012年的小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)中，對(duì)64份甘藍(lán)型油菜取樣進(jìn)行小孢子分離培養(yǎng)(圖1)，不同材料胚狀體發(fā)生頻率差異較大?；蛐?L007，0L011，11568等材料，平均產(chǎn)胚率均超過(guò)20個(gè)/蕾，而有些基因型材料如03250，03255，和AM052等多次取樣分離培養(yǎng)，均不能獲得胚狀體。這些結(jié)果表明在相同培養(yǎng)條件下，不同基因型之間的產(chǎn)胚率存在很大的差異。通過(guò)2011—2012兩年的小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)，篩選出7個(gè)在江西南昌氣候條件下高成胚率基因型材料，它們平均最高產(chǎn)胚量大于20個(gè)/蕾，分別是:0L007，0L008，0L011，0L032，11568，1L023和1L027?？衫眠@些材料通過(guò)小孢子培養(yǎng)的手段進(jìn)行誘變育種篩選和轉(zhuǎn)基因等相關(guān)研究，有著重要的理論研究和應(yīng)用價(jià)值。

圖1 2011—2012年不同基因型材料產(chǎn)胚率分布情況Fig.1 embryo yield among different genotypes in 2011 and 2012

2.2 低溫預(yù)處理對(duì)產(chǎn)胚率的影響

由圖2可知，花蕾低溫預(yù)處理對(duì)4個(gè)基因型材料的產(chǎn)胚率都有影響，且隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)胚率總體上呈先上升，后下降的規(guī)律，但不同基因型材料對(duì)低溫預(yù)處理所需時(shí)間也不盡相同。如1L002的對(duì)照產(chǎn)胚率為3.93個(gè)/蕾，低溫預(yù)處理6 h產(chǎn)胚率達(dá)到最高，為4.85個(gè)/蕾，而1L023基因型材料低溫預(yù)處理24 h后，產(chǎn)胚率才達(dá)到最高，為30.75個(gè)/蕾。上述結(jié)果表明低溫預(yù)處理可以提高小孢子胚誘導(dǎo)的頻率，但不同基因型材料胚產(chǎn)量隨預(yù)處理時(shí)間的變化規(guī)律也有差異，這可能表明不同基因型材料小孢子脫分化及胚胎發(fā)生對(duì)預(yù)處理的反應(yīng)不同。

此外，不同基因型材料對(duì)低溫預(yù)處理時(shí)間的耐受程度也不同，1L023和1L027耐受程度較高，低溫預(yù)處理4 d后仍能保持較高的產(chǎn)胚率，分別為12.85個(gè)/蕾和23.40個(gè)/蕾，而1L002和1L014耐受程度則較低，超過(guò)2 d后產(chǎn)胚率就開始急劇下降。

2.3 簡(jiǎn)化小孢子B5分離洗液配方

在搗碎花蕾、離心收集小孢子的過(guò)程中，分別使用兩種分離洗液:B5-13%蔗糖和13%蔗糖溶液，分析不同分離洗液處理下產(chǎn)胚率的差異。

方差分析結(jié)果表明(表1)，不同洗液配方處理間差異未達(dá)到顯著水平。因此在小孢子提取和分離過(guò)程中，不同分離洗液配方對(duì)后期產(chǎn)胚率沒(méi)有顯著影響。在分離洗液中蔗糖濃度影響滲透壓，滲透壓對(duì)小孢子的活力很重要，太高或太低都可能導(dǎo)致小孢子失水或膨脹，影響小孢子活力，因此保持一定的蔗糖濃度是必須的[7]。而在搗碎花蕾、離心收集小孢子的過(guò)程中因?yàn)闀r(shí)間相對(duì)較短，小孢子對(duì)養(yǎng)分的需求并不高，因此只需維持正常的滲透壓，直接使用13%蔗糖溶液分離小孢子即可，不用再另外配制B5培養(yǎng)液，簡(jiǎn)化分離培養(yǎng)方法。

圖2 低溫預(yù)處理對(duì)產(chǎn)胚率的影響Fig.2 Effect of low temperature treatment on embryo yield

表1 不同分離洗液配方對(duì)產(chǎn)胚率的影響Tab.1 The effect of different separation lotion formula on embryo yields

圖3 32℃熱擊培養(yǎng)1 d后小孢子培養(yǎng)反應(yīng)Fig.3 Microspore culture response after one day’s heat shock culture

2.4 分離培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡下小孢子培養(yǎng)反應(yīng)與產(chǎn)胚的關(guān)系

32℃熱擊培養(yǎng)1 d后，將裝有小孢子的培養(yǎng)皿取出，在倒置顯微鏡下觀察1.1中所列64份材料的小孢子培養(yǎng)反應(yīng)。根據(jù)倒置顯微鏡下小孢子膨大反應(yīng)情況，將小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)分為3個(gè)等級(jí):好、一般和無(wú)培養(yǎng)反應(yīng)。培養(yǎng)反應(yīng)好(圖3A):在任意一個(gè)視野中都可以看得大量小孢子發(fā)生明顯的體積膨大、體積約為剛分離小孢子的2～4倍，并呈現(xiàn)透明狀。培養(yǎng)反應(yīng)一般(圖3B):可以觀察到有小孢子發(fā)生明顯的體積膨大，但數(shù)量不多。無(wú)培養(yǎng)反應(yīng)(圖3C):沒(méi)有觀察到小孢子發(fā)生明顯的體積膨大。觀察記錄完后將培養(yǎng)皿放回繼續(xù)培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)材料的產(chǎn)胚率。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律(圖4):①所有倒置顯微鏡下無(wú)培養(yǎng)反應(yīng)的材料都沒(méi)有出胚;②所有產(chǎn)胚率大于10個(gè)/蕾的材料在倒置顯微鏡下的培養(yǎng)反應(yīng)等級(jí)都是好;③培養(yǎng)反應(yīng)等級(jí)為一般的材料可能出胚也可能不出胚，但產(chǎn)胚率都不高。因此，可以在分離培養(yǎng)小孢子24 h后，根據(jù)倒置顯微鏡下觀察小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)作出是否繼續(xù)收集培養(yǎng)的判斷，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)反應(yīng)不好或沒(méi)有培養(yǎng)反應(yīng)，可直接淘汰，無(wú)需再重新收集小孢子，轉(zhuǎn)到不含秋水仙堿的NLN－13培養(yǎng)基中，以節(jié)省時(shí)間，也可重新取樣分離培養(yǎng)，以免錯(cuò)過(guò)花期。

圖4 分離培養(yǎng)24 h后小孢子培養(yǎng)反應(yīng)與產(chǎn)胚的關(guān)系Fig.4 The relations between microspore culture response and embryo yield

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在相同培養(yǎng)條件下，不同基因型之間甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率存在很大差異。星曉蓉等[8]對(duì)22份春性甘藍(lán)型油菜進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的結(jié)果也表明，不同組合平均每蕾產(chǎn)胚量在0－36.94個(gè)，出胚率差異比較大。余風(fēng)群[9]、史慶馨等[10]也有類似報(bào)道。這都進(jìn)一步說(shuō)明基因型是決定胚狀體發(fā)生的關(guān)鍵因素。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，不同基因型材料小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的差異具體表現(xiàn)在出胚的難易，產(chǎn)胚的數(shù)量及胚狀體的質(zhì)量等方面。據(jù)報(bào)道，目前最易形成胚狀體的兩個(gè)材料是Topas和G231[11－12]。

Takahashi[13]曾報(bào)道低溫預(yù)處理能明顯提高油菜小孢子培養(yǎng)的胚狀體發(fā)生頻率。本實(shí)驗(yàn)延長(zhǎng)了低溫預(yù)處理的時(shí)間跨度，研究了不同基因型材料在不同低溫預(yù)處理時(shí)間條件下的產(chǎn)胚率變化，結(jié)果也顯示低溫預(yù)處理能夠提高小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率，且隨著低溫預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)胚率總體呈先上升，后下降的規(guī)律。后期產(chǎn)胚率下降主要是由于長(zhǎng)時(shí)間低溫處理及新陳代謝，“體內(nèi)”物質(zhì)耗盡，影響了小孢子的正常發(fā)育，造成產(chǎn)胚率下降[14]。目前，關(guān)于低溫預(yù)處理如何提高小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生頻率的作用機(jī)制并沒(méi)有完全明確。有學(xué)者推測(cè)，通過(guò)低溫預(yù)處理，改變了花藥內(nèi)源激素的含量或造成了花藥中游離氨基酸總量的明顯升高，而這種變化可以看作是花粉由配子體向孢子體發(fā)育的一種信號(hào)[15]。在我國(guó)，油菜小孢子培養(yǎng)的供體植株大多生長(zhǎng)在大田環(huán)境下，容易受天氣等因素影響，尤其對(duì)于中熟或中偏遲熟材料，初花期較遲，花期短，往往遇高溫天氣，導(dǎo)致小孢子發(fā)育時(shí)期趨于不一致，小孢子培養(yǎng)的脫分化啟動(dòng)及胚狀體誘導(dǎo)均較困難。低溫預(yù)處理不僅可作為一種有效措施，提高自然條件下的甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體發(fā)生頻率[16]，而且在溫度升高前，提前集中取樣，置于4℃條件下保存，在一定程度上可避免或減少高溫天氣對(duì)小孢子培養(yǎng)的不利影響。

搗碎花蕾、離心收集小孢子的過(guò)程時(shí)間相對(duì)較短，在短時(shí)間內(nèi)維持小孢子的活力可能并不一定需要較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持一定的滲透壓即可。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將分離洗液的配方由以前慣用的B5－13%蔗糖換成13%蔗糖溶液后，對(duì)小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率沒(méi)有實(shí)質(zhì)影響。因此，在配制小孢子培養(yǎng)所需藥品時(shí)，可剔除B5營(yíng)養(yǎng)成分，簡(jiǎn)化配方。

對(duì)于倒置顯微鏡下小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)與小孢子胚胎發(fā)生的關(guān)系，黃先群等[17]發(fā)現(xiàn)，熱激培養(yǎng)2 d后小孢子的膨大率是衡量小孢子胚狀體是否發(fā)生的一個(gè)有效指標(biāo)。當(dāng)小孢子的膨大比例超過(guò)50%時(shí)，胚狀體發(fā)生出現(xiàn)質(zhì)的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)出集體效應(yīng)。這種集體效應(yīng)促使小孢子的發(fā)育轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑。李華等[18]研究發(fā)現(xiàn)，茄子中離體小孢子的膨大率和活力可作為小孢子誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生潛能的早期指標(biāo)，同時(shí)提出，可通過(guò)梯度離心等方式，對(duì)熱擊培養(yǎng)后發(fā)生膨大，有較高胚狀體發(fā)生潛能的小孢子進(jìn)行純化，避免死亡的小孢子可能釋放不利于細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，對(duì)小孢子造成毒害，從而提高小孢子的胚狀體發(fā)生頻率。國(guó)內(nèi)甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)供體材料大多植于大田，小孢子培養(yǎng)通常集中在一定時(shí)期進(jìn)行，按照小孢子胚誘導(dǎo)及生長(zhǎng)發(fā)育的速度，當(dāng)分離培養(yǎng)15 d左右觀察到無(wú)法獲得胚狀體時(shí)，很可能已錯(cuò)過(guò)花期，無(wú)法再重新取樣培養(yǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，可以在分離培養(yǎng)小孢子24 h后，根據(jù)倒置顯微鏡下觀察小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)作出是否繼續(xù)收集培養(yǎng)的判斷，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)反應(yīng)不好或沒(méi)有培養(yǎng)反應(yīng)，可直接淘汰，無(wú)需再重新收集小孢子，轉(zhuǎn)到不含秋水仙堿的NLN－13培養(yǎng)基中，以節(jié)省時(shí)間，也可重新取樣分離培養(yǎng)，以免錯(cuò)過(guò)花期。

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