西藏部分地區(qū)藏豬弓形蟲血清學(xué)調(diào)查研究

貢 嘎 普 瓊 落桑阿旺 米 瑪 索朗斯珠*

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，林芝 860000；

2.西藏日喀則地區(qū)中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，日喀則 857000）

西藏部分地區(qū)藏豬弓形蟲血清學(xué)調(diào)查研究

貢 嘎1普 瓊2落桑阿旺1米 瑪1索朗斯珠1*

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，林芝 860000；

2.西藏日喀則地區(qū)中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，日喀則 857000）

為了掌握藏豬弓形蟲感染情況，本試驗(yàn)應(yīng)用間接血凝試驗(yàn)（ⅠHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELⅠSA）及弓形蟲膠體金檢測卡，對西藏部分地區(qū)藏豬血清進(jìn)行了弓形蟲抗體檢測。結(jié)果表明：在檢測的195份藏豬血清樣品中ⅠHA檢出率為3.1%，ELⅠSA 檢出率為5.1%，膠體金檢測卡檢出率為1%。說明西藏部分地區(qū)藏豬群中存在不同程度的弓形蟲感染。

藏豬 弓形蟲 血清學(xué)調(diào)查

*通訊作者：索朗斯珠（1971－），女，藏族，教授，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)博士，研究方向：人獸共患病。

弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種人獸共患性寄生蟲病，該病在全世界廣泛流行。西方國家人群平均感染率高達(dá)15%左右[1]，我國人體平均感染率達(dá)8%[2]。此病主要引發(fā)母豬死胎、流產(chǎn)，仔豬發(fā)熱、呼吸困難、衰竭等癥狀，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降或死亡，當(dāng)與免疫抑制性病原共同感染時，將會造成更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了摸清西藏地區(qū)藏豬弓形蟲感染情況，作者于2011～2012年初步對西藏拉薩、林芝部分地區(qū)藏豬進(jìn)行豬弓形蟲病血清學(xué)檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

從西藏拉薩市堆龍縣、墨竹工卡縣、林周縣、達(dá)孜縣、尼木縣、曲水縣，林芝地區(qū)米林縣、林芝縣等地個體養(yǎng)豬戶共采集藏豬血樣195份，分離血清待檢。

1.1.2 檢測試劑

弓形蟲間接血凝試驗(yàn)（IHA）試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，IHA抗原批號是120301，陽性對照血清批號是110925，陰性對照血清批號是110925，稀釋液批號是2030；豬弓形蟲抗體（IgG）診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）、弓形蟲膠體金檢測卡均購自深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)分析儀，型號：RT-6100，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 檢測方法

1.2.1 間接血凝試驗(yàn)（ⅠHA）

按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T573-2002的規(guī)定，在96（12×8）孔l10V形有機(jī)玻璃板上進(jìn)行檢測，弓形蟲IHA診斷制劑按瓶上標(biāo)示毫升數(shù)加入滅菌蒸餾水稀釋搖勻，15 000r/min離心5～10min，棄上清液，加等量的稀釋液搖勻，置4℃靜置24 h后使用。

1.2.1.1 操作方法

在96孔1100V 型反應(yīng)板中每孔加入75μl稀釋液。在反應(yīng)板的第1孔加待檢血清、陽性對照血清、陰性對照血清各25μl。稀釋至第3孔，第4孔為稀釋液對照。將診斷液搖勻，每孔加25μl診斷液后置微型振蕩器上振蕩2min，蓋上玻璃于37℃作用2h后觀察結(jié)果。

1.2.1.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

在陽性對照血清效價不低于1∶1 024，陰性對照血清除第1孔允許有前滯現(xiàn)象“+”外、其余各孔均為“-”，稀釋對照為“-”的前提下，對待檢血清進(jìn)行判定，否則重做。待檢血清效價≥1∶64，判為陽性，反之為陰性。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELⅠSA）

1.2.2.1 操作方法

加樣：設(shè)陰性對照、陽性對照各2孔，分別加入不稀釋的陰、陽性對照血清100μl于相應(yīng)孔中。其余為樣本孔，每孔加100μl樣本稀釋液，再分別加入樣本10 μl。溫育：加好樣后振蕩10s，充分混勻，置37℃溫育30 min。洗板：甩去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿反應(yīng)板孔，洗滌5次，每次停留1 min，最后一次洗后晾干。加酶：每孔加酶標(biāo)記物100 μl。溫育：置37℃溫育30 min。洗板：同上。顯色：每孔加顯色劑A、顯色劑B各50μl，振蕩混勻，37℃避光反應(yīng)15 min。終止：每孔加終止液50 μl，振蕩10 s，充分混勻。終止后5～30 min內(nèi)讀數(shù)。

1.2.2.2 結(jié)果判定

臨界值（CO.）=0.15。樣本A值（S）/臨界值（CO.）≥1，判定為TOX-IgG陽性；S/CO.＜1，判定為TOX-IgG陰性。陰性對照血清A值應(yīng)小于0.10，陽性對照A值應(yīng)大于0.70，否則試驗(yàn)不成立，需重新做。

1.2.3 弓形蟲膠體金檢測卡

1.2.3.1 操作方法

在檢測卡的加樣孔內(nèi)加入2滴（100μl）待檢血清樣品。將檢測卡平放于桌面上，在室溫下靜置5～20min內(nèi)判定結(jié)果。超過20min的結(jié)果只能作為參考。

1.2.3.2 結(jié)果判定

陽性：在觀察孔內(nèi)，檢測線區(qū)（T）及對照線區(qū)（C）同時出現(xiàn)紫紅色線。弓形蟲抗體滴度越高，檢測線（T）顏色越深。弱陽性：在觀察孔內(nèi)，檢測線區(qū)（T）及對照線區(qū)（C）同時出現(xiàn)紫紅色線。陰性：在觀察孔內(nèi)，只有對照線區(qū)（C）出現(xiàn)一條紫紅色線。失效：在觀察孔內(nèi)，對照線區(qū)（C）和檢測線區(qū)（T）都不出現(xiàn)紅色線；或僅檢測線區(qū)（T）出現(xiàn)紅色線。

2 結(jié)果

血清學(xué)檢測結(jié)果詳見表1。

2.1 IHA法檢測結(jié)果

從個體養(yǎng)豬戶收集豬血清195份，IHA方法檢測到6份為抗體陽性，抗體陽性率為3.1%。

2.2 酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果

從個體養(yǎng)豬戶收集豬血清195份，ELISA方法檢測到10份為抗體陽性，抗體陽性率為5.1%。

2.3 膠體金檢測結(jié)果

從個體養(yǎng)豬戶收集豬血清195份，膠體金檢測卡檢測到2份為抗體陽性，抗體陽性率為1%。

表1 血清學(xué)檢測結(jié)果

表2 西藏部分地區(qū)藏豬弓形蟲感染率與國內(nèi)部分地區(qū)的比較[3-7]

3 討論

3.1 感染區(qū)域比較

弓形蟲是一種呈世界性分布的人獸共患寄生蟲病，該病的流行程度因當(dāng)?shù)氐娘L(fēng)俗文化、衛(wèi)生設(shè)施和狀況、地理位置及民族飲食習(xí)慣等諸多因素的不同而有所差異。而有關(guān)西藏地區(qū)弓形蟲血清學(xué)調(diào)查文獻(xiàn)報導(dǎo)甚少，故只能通過與其他省份進(jìn)行比較和討論。從表2可以看出，本次調(diào)查結(jié)果與國內(nèi)某些省份相比較低。但西藏豬弓形蟲病的流行情況及其危害性與其他的地區(qū)相比是高還是低，需要更多方面的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，有待進(jìn)一步分析。

3.2 檢測方法比較

3.2.1 間接血凝試驗(yàn)（ⅠHA）

該方法簡便、快速，主要應(yīng)用于基層臨床檢查。但I(xiàn)HA方法存在與犬新孢子蟲的交叉反應(yīng)、重復(fù)性差、抗原不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELⅠSA）

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)比其他血清學(xué)反應(yīng)的敏感性和特異性高，檢出率為5.1%，較其他2種方法檢出率高。但此方法實(shí)驗(yàn)條件要求較高，基層難以采用。

膠體金法檢測具有簡便、快速無需特殊設(shè)備及結(jié)果易于判斷的優(yōu)勢，但膠體金法敏感度、特異性偏低，本次實(shí)驗(yàn)此法檢出率為1%，較IHA法和ELISA法的檢出率低，因此此法主要用于初篩。

[1] Dubey J P.The history of Toxoplasmagondii-the first 100 years[J].Eukaryot Microbiol.2008，（55）：467-475.

[2] 汪明.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)[M].第3 版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[3] 米曉云，巴音查汗，李文超.新疆豬、牛、羊弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，2007，15（2）：22-24.

[4] 葉玉美，魏德瓊，涂育發(fā).云南省動物弓形蟲調(diào)查[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2002，20（4）：255.

[5] 朱繼斌.河北省豬弓形蟲感染情況調(diào)查[J].河北北方學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，22（2）：46-48.

[6] 王天奇，董發(fā)明，潘耀謙，等.洛陽地區(qū)豬弓形體病血清學(xué)調(diào)查與分析[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2006，（9）：29-30.

[7] 晁學(xué)元，郭全輝.青海樂都豬弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44（5）：40.

西藏農(nóng)牧學(xué)院青年教師基金，西藏自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新性項(xiàng)目。