關(guān)于LAMP技術(shù)檢測禽白血病病毒J亞群的特異性及靈敏性的分析

楊君照 徐 凱 白 玉 劉金堯 王建玉

（1.江蘇省鹽城市阜寧縣東溝鎮(zhèn)人民政府，鹽城 224000；

2.江蘇省鹽城市農(nóng)業(yè)委員會，鹽城 224000；

3.山西省大同市畜禽管理所，大同 037000；

4.江蘇省新沂市農(nóng)業(yè)委員會，新沂 221400；

5.江蘇省連云港市灌云縣住建局，連云港 222000）

關(guān)于LAMP技術(shù)檢測禽白血病病毒J亞群的特異性及靈敏性的分析

楊君照1徐 凱2白 玉3劉金堯4王建玉5

（1.江蘇省鹽城市阜寧縣東溝鎮(zhèn)人民政府，鹽城 224000；

2.江蘇省鹽城市農(nóng)業(yè)委員會，鹽城 224000；

3.山西省大同市畜禽管理所，大同 037000；

4.江蘇省新沂市農(nóng)業(yè)委員會，新沂 221400；

5.江蘇省連云港市灌云縣住建局，連云港 222000）

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增LAMP是一門新興的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，由于其具有特異性高、敏感性高、簡單、快速、廉價、易檢測等特點(diǎn)，受到了生物醫(yī)學(xué)研究者的高度關(guān)注。本文旨在分析禽白血病病毒J亞群LAMP法檢測體系的特異性，并比較LAMP法與常規(guī)PCR法在檢測禽白血病病毒J亞群中的敏感性。結(jié)果顯示，在禽白血病病毒J亞群病毒中，無交叉反應(yīng)；而靈敏性分析結(jié)果顯示，LAMP法在檢測ALV-J過程中其敏感性勝于常規(guī)PCR。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 J亞群白血病 lk特異性 敏感性

禽白血病病毒 J 亞群（ALV-J）在我國及世界各國的禽病中影響越來越為廣泛，并且在我國形成一種蔓延的趨勢，它是一種以能誘導(dǎo)肉雞產(chǎn)生骨髓細(xì)胞瘤?。∕L）、腎瘤和其他多種腫瘤，死亡率為1%～2%，偶爾可高達(dá)20%的一種禽類疾病。而目前對此病的診斷方法主要是ELISA、PCR為主，但對實驗的條件及其人員要求相對較高，而環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）是由Notomi等人設(shè)計并用于鑒別病毒及其他病原體的一種新型檢測方法。本項技術(shù)主要是利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在等溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)基因的擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測。其具有高效、靈敏、快速、方便等特點(diǎn)。本次實驗就該項技術(shù)對于ALV-J的靈敏性及特異性做了相關(guān)的研究。

1 試驗材料

1.1 材料

毒株：揚(yáng)州大學(xué)秦愛建實驗室ALV-J JSNT株，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中實驗室ALV-JNX0101株，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)SCAU-0901，SCAU-CHN，RAV-1，RAV-2，ALV-A，ALV-B，ALV-E等10株。

1.2 主要儀器和設(shè)備

動物飼養(yǎng)設(shè)備，PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，離心機(jī)，水浴鍋，細(xì)胞培養(yǎng)箱，二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.3 主要試劑

引物合成，蛋白酶K、PCR試劑，RNA提取試劑盒，消化液，5×TBE電泳緩沖液/L，54 gTris堿，27.5 g硼酸，20 ml EDTA（0.5M、pH8.0），室溫保存，使用時5倍稀釋。50×TAE電泳緩沖液/L：242 gTris堿，57.1 ml冰乙酸，100 ml EDTA（0.5M、pH8.0），室溫保存，使用時50倍稀釋。LAMP試劑，限制性內(nèi)切酶，胎牛血清，Bst大片段鏈置換酶，SYBR green I dye，反轉(zhuǎn)錄酶M-Mulv、Rnase Inhibitor，隨機(jī)引物、DEPC處理水.

2 試驗方法與步驟

2.1 病毒核酸的提取

使用RNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

2.2 樣品制備

2.2.1 RNA反轉(zhuǎn)錄

50 ul體系（按照本實驗室經(jīng)典體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參數(shù)如下）

2.2.2 反轉(zhuǎn)錄步驟

將提取的病毒核酸溶于DEPC處理過的DDW中，70℃反應(yīng)5 min；拿出后立即冰水浴，稍離心，依次加入RNA酶抑制劑，反轉(zhuǎn)錄酶及其Buffer、dNTP、42 ℃反應(yīng)1 h；拿出后95℃反應(yīng)以滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性，4 ℃保存，用于LAMP及PCR檢測。

2.3 引物設(shè)計及反應(yīng)體系

2.3.1 引物設(shè)計

對于ALV-J通過專門的LAMP引物設(shè)計軟件Primer Explorer V3軟件（Eiken Chemical Co.Ltd.，Tokyo，Japan）的設(shè)計以及以及上海生物工程有限公司的合成。得到如下引物：

成果轉(zhuǎn)化服務(wù)人才隊伍建設(shè)方面存在的問題 科技成果轉(zhuǎn)化往往需要資金和市場，轉(zhuǎn)化需要包括技術(shù)研發(fā)、技術(shù)經(jīng)紀(jì)、技術(shù)市場把握、與企業(yè)溝通談判等在內(nèi)的團(tuán)隊協(xié)同工作，從目前的情況分析來看，江蘇師范大學(xué)要不斷地加大比較熟悉市場且懂得相應(yīng)技術(shù)的中介人才隊伍的建設(shè)，從而推動學(xué)校專利成果轉(zhuǎn)化。

2.3.2 反應(yīng)體系

2.3.2.1 LAMP反應(yīng)體系為25μl 1×ThermoPol buffer（New England BiolabsInc.，U SA），6mM Mg2+，0.8mM dNTPs，0.25μM外引物（F3和B3），1.0μM內(nèi)引物（FIP和B IP），1μl模板DNA，8U Bst聚合酶（New England Biolabs），0.4M甜菜堿（Sigma-Aldrich Inc.，MO，USA），20 mM Tris-HCl，10mM KCl，10 mM（NH4）2SO4。反應(yīng)條件：63℃恒溫45min，然后85℃恒溫5 min。

2.3.2.2 PCR反應(yīng)體系為25 ul 10×擴(kuò)增緩沖液2.5ul，1.5 ulM Mg2+，0.5 ul Taq DNA聚合酶，0.5 ul 模板DNA，引物各0.5 ul，2 ul MdNTP。

Method Primer name length Sequence（5’-3’）LAMP F3 19 GCAACCAGGGAACCTTTGG B3 20 GCTGACGAGACTAACCGATC FIP 38 AAGGGGAGGTGGCTGACTGTTTACATGGGCCGACCGTA BIP 40 ATCCCGTCCCCTATTTCCGAGGTTCCCAAGGTGGTGCAATT PCR H5 20 GGATGAGGTGACTAAGAAAG H7 20 GGAACCAAAGGTAACACACG

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：在95℃下5 min使得模板DNA變性，并在94℃下維持30 s。置于50℃下1 min，因為退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高，延伸反應(yīng)72℃維持40 s并做30輪的循環(huán)擴(kuò)增。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10 min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分，并且在16℃下保存。

2.4 特異性的試驗

2.4.1 LAMP擴(kuò)增特異性及產(chǎn)物的檢測方法

用Dde Ⅰ內(nèi)切酶確定LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂凝膠電泳檢測：瓊脂糖濃度為2%，50×TAE電泳緩沖液/L，以恒定電壓120V電泳45 min，最后用紫外線燈檢測擴(kuò)增條帶。

熒光檢測：產(chǎn)物中加SYBR GreenI，肉眼觀察顏色反應(yīng)；呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)。在紫外光照射下呈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng)。

2.4.2 ALV-J病毒LAMP檢測方法特異性

取ALV-J（JSNT、JNX0101、SCAU-0901、SCAU-CHN）、ALV-A、ALV-B、RAV-1、RAV-2、ALV-E1、ALV-E2為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，按照其體系進(jìn)行檢測，分析其特異性。

2.5 敏感性的試驗

LAMP VS Conventional PCR

2.5.1 倍比稀釋比較

用10-1-10-9稀釋度的ALV-J病毒為模板分別進(jìn)行LAMP、常規(guī)PCR，分析LAMP檢測靈敏性。

2.5.2 用質(zhì)粒載體克隆方式比較

為了比較LAMP及常規(guī)PCR檢測反應(yīng)的敏感性，將JSNT株中PCR擴(kuò)增的545bp的特異性擴(kuò)增片段進(jìn)行純化，然后克隆至pGEM-T載體中，重組質(zhì)粒放入LB培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。重組質(zhì)粒DNA采用QIAprep Spin Miniprep試劑盒提取（QIAGEN，CA，USA），進(jìn)行序列驗證，陽性質(zhì)粒采用260 nm紫外分光光度計定量，然后倍比稀釋用于兩種方法的敏感性比較。

3 試驗結(jié)果

試驗結(jié)果有3種判定方法：①瓊脂糖電泳后，用SYBR GreenI染色檢測。②產(chǎn)物中加入Mg2+試劑，肉眼觀測副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，產(chǎn)物呈陽性的反應(yīng)，則管內(nèi)液體渾濁，離心或由白色沉淀集于管底，陰性反應(yīng)則無此現(xiàn)象。③產(chǎn)物中加SYBR GreenI，肉眼觀察顏色反應(yīng)；呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)；在紫外光照射下呈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng)。

3.1 LAMP在ALV-J基因檢測中的擴(kuò)增特異性及產(chǎn)物檢測

分別用瓊脂糖凝膠電泳法、白色沉淀法和SYBR green I綠色熒光法檢測LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物。用Dde Ⅰ內(nèi)切酶確定其特異性，如圖2 B。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳圖譜上呈梯狀（泳道1），經(jīng)過內(nèi)切酶消化，出現(xiàn)了200 bp，267 bp 或 314 bp三條泳帶（泳道2）與理論值相符合，說明是特異性的擴(kuò)增。SYBR green I 熒光檢測中，一管為綠色（圖1 B），另一管為桔黃色（圖1 B），綠色表明結(jié)果為陽性，桔黃色為陰性。

圖1 白色沉淀法和SYBR green Ⅰ綠色熒光法

圖1A擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Mg2+試劑，左邊管有產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，呈陽性反應(yīng)，液體渾濁，離心或由白色沉淀集于管底，右側(cè)陰性反應(yīng)則無此現(xiàn)象。B中產(chǎn)物中加SYBR GreenI，肉眼觀察顏色反應(yīng)；呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)。在紫外光照射下呈綠色熒光的為陽性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng)。

3.2 ALV-J病毒ALMP檢測方法的特異性

以其他病毒為模板檢測體系的特異性，實驗結(jié)果如圖2A。具體檢測結(jié)果如附表；由此可知，ALV-J病毒LAMP檢測法只擴(kuò)增ALV-J病毒核酸而不擴(kuò)增其他非目標(biāo)核酸，因此其建立的LAMP具有良好的檢測特異性。

圖2 禽白血病J亞型病毒檢測方法特異性

圖2A以ALV-J（JSNT、JSNT、SCAU-0901、SCAU-CHN）、ALV-A、ALV-B、RAV-1、RAV-2、ALV-E1、ALV-E2為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，ALV-J（NX0101、JSNT、SCAU-0901、SCAUCHN）出現(xiàn)擴(kuò)增，其他病毒未出現(xiàn)擴(kuò)增。圖2B擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳圖譜上呈梯狀（泳道1），經(jīng)過內(nèi)切酶消化，出現(xiàn)了200 bp，267 bp，or 314 bp三條泳帶（泳道2）

表 ALV-J與其他病毒特異性檢測結(jié)果

3.3 LAMP在ALV-J基因檢測中的靈敏度的測試

以10-1～10-9稀釋度的ALV-J病毒DNA為模板分別進(jìn)行了LAMP、常規(guī) PCR，分析LAMP檢測靈敏性，結(jié)果如圖3。LAMP可以檢測到5個拷貝的核酸，如圖3。但是，ALV-J病毒在realtime PCR法只能檢測到102個拷貝的核酸。經(jīng)過幾次試驗都得到了相似的結(jié)果。由此可見，所建立的ALV-J病毒LAMP檢測法較常規(guī) PCR靈敏性高。

圖3 LAMP及常規(guī)PCR的靈敏度的測試

圖3 LAMP可以檢測到5個拷貝的核酸，realtime PCR法能檢測到102個拷貝的核酸

4 討論及其分析

4.1 LAMP 特異性測試

LAMP之所以有很強(qiáng)的特異性，是因為四條特異性的引物可以識別靶基因當(dāng)中的六個特異序列，從而使得LAMP擴(kuò)增的高特異性。在LAMP產(chǎn)物檢測的3種方法當(dāng)中，就LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂凝膠電泳圖譜上之所以呈梯狀，主要是由于擴(kuò)增產(chǎn)物的左后產(chǎn)物為莖環(huán)DNA組成的混合物，也就是說其中有若干倍莖長度的類似花椰菜結(jié)構(gòu)的莖環(huán)DNA。其次，DdeⅠ內(nèi)切酶消化的這一結(jié)果表明了試驗的結(jié)果與理論預(yù)期是一致的，證明了LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。LAMP核酸擴(kuò)增當(dāng)中，由于焦磷酸根離子與反應(yīng)液中的Mg2+相結(jié)合從而產(chǎn)生了焦磷酸鎂白色沉淀，因此還可通過相關(guān)的濁度儀進(jìn)行檢測，實現(xiàn)它的定量和實時監(jiān)測。如果LAMP有擴(kuò)增產(chǎn)物，則向反應(yīng)溶液中加入SYBR green I dye，SYBR green I就會與DNA相結(jié)合，可以當(dāng)即用肉眼進(jìn)行觀察，反應(yīng)溶液為綠色則為陽性；反應(yīng)溶液為橘黃色則為陰性。3種方法中，以綠色熒光檢測最為迅速，便捷，可靠，可以實現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測的需求。

4.2 LAMP 靈敏度測試

在試驗過程中，通過與普通PCR的比較，LAMP的高靈敏度，是由于擴(kuò)增模板量可低至10拷貝或更少，而產(chǎn)物擴(kuò)增指數(shù)達(dá)109～1010拷貝，因此其靈敏性相對較高。LAMP檢測方法具有很高的靈敏性，檢測極限相對較高，能夠很大程度上的實現(xiàn)現(xiàn)場快速初檢的需求。

4.3 綜合評價

就此次實驗而言，雖然LAMP的原理相對復(fù)雜，但是所建立的關(guān)于ALV-J病毒LAMP檢測體系，是一項可以在等溫條件下，具有快速、便捷、高效、靈敏的一項檢測技術(shù)，用于現(xiàn)場的快速檢測，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備，對于人員要求也相對不高，是一個快速、便捷的新方法。當(dāng)然，在本次試驗中還存在一些不足之處，比如特異性試驗中的毒株在實驗過程中由于各方面原因還差一些亞群不能獲得，造成了試驗的欠缺。其次LAMP技術(shù)并未與RT-PRC進(jìn)行對比。然后，LAMP在臨床應(yīng)用上還有待廣泛應(yīng)用。LAMP是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，在某些方面可能仍然存在一些不足，例如Nagamine曾報道DNA 模板在不預(yù)變性的條件下也能發(fā)生LAMP 擴(kuò)增，但其機(jī)制尚不清楚，如果這種現(xiàn)象的原因得以闡明，將進(jìn)一步簡化LAMP 技術(shù)的操作程序。Maruyama曾報道不使用外引物也能產(chǎn)生特異性的階梯狀條帶。此外，LAMP 擴(kuò)增的產(chǎn)物不易分析，在數(shù)篇文獻(xiàn)報道中LAMP 擴(kuò)增的梯度性條帶的帶型存在差異。與此同時，引物設(shè)計難度大也是限制LAMP 技術(shù)推廣的因素。但是，相信隨著相關(guān)研究的不斷深入，將會使LAMP技術(shù)得到更好的發(fā)展及完善，從而能更好的服務(wù)于社會。

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