尿Netrin-1與NGAL聯(lián)合檢測(cè)在成人體外循環(huán)術(shù)后急性腎損傷早期診斷中的意義

陳玉 ，王艷琴 ，蔡利勵(lì) ，鄭劍鋒 ，王小中

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、南昌市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330003)

急性腎損傷(AKI)是體外循環(huán)(CPB)術(shù)后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療可防止病情進(jìn)一步惡化，改善患者預(yù)后[1,2]。目前臨床還缺乏敏感、特異早期診斷AKI的指標(biāo)，傳統(tǒng)的臨床檢測(cè)難以早期發(fā)現(xiàn)AKI，無(wú)法滿足早期診斷的需要。目前國(guó)內(nèi)對(duì)NGAL作為早期診斷AKI標(biāo)志物的研究較多[3,4]，并取得了一定進(jìn)展，而Netrin-1對(duì)AKI早期預(yù)測(cè)和診斷作用的臨床研究則罕有報(bào)道。本研究通過對(duì)比分析CPB術(shù)后尿樣中Netrin-1及NGAL水平的變化，探討其在CPB術(shù)后AKI早期診斷中的價(jià)值與意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇本院2012年6月至2012年12月在CPB下行心臟手術(shù)的成人患者213例，年齡 18～75(59.5±14.6)歲，包括心臟瓣膜手術(shù)、先天性心臟病矯治術(shù)、CPB下冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、主動(dòng)脈弓置換術(shù)等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前合并腎功能不全者；(2)術(shù)前或研究期間使用過腎毒性藥物者；(3)術(shù)前和(或)術(shù)后3d內(nèi)有尿路感染者；(4)術(shù)中及術(shù)后3天死亡者。

1.2 標(biāo)本收集及儲(chǔ)存 CPB術(shù)后第一個(gè)12 h內(nèi)每2 h采集尿及血標(biāo)本1次，此后72h內(nèi)每12 h采集1次，每次各5ml,標(biāo)本采集后15min內(nèi)以2500r/min離心10min，取上清液保存于-80℃冰箱統(tǒng)一檢測(cè)。

1.3 標(biāo)本檢測(cè) 用AU2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肌酐(Scr)及尿肌酐(Ucr)水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)尿Netrin-1(美國(guó)R&D RB BD公司)及NGAL(美國(guó)R&D公司)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。為了減少檢測(cè)誤差，生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)均復(fù)孔后取均值，尿標(biāo)志物則與Ucr比值校正。AKI的定義標(biāo)準(zhǔn)：Scr比正?；A(chǔ)水平升高50%以上[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，繪制受試者工作特征(Receiver-operating characteristic，ROC)曲線并計(jì)算曲線下面積，以評(píng)價(jià)Netrin-1及NGAL早期診斷AKI的敏感性和特異性，曲線下面積越小效果越差，當(dāng)面積接近1.0效果最佳，并有望成為理想的生物學(xué)標(biāo)志，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPB術(shù)后AKI發(fā)生率 術(shù)后72h內(nèi)有40例患者發(fā)生不同程度的AKI，歸為AKI組，發(fā)生率18.8%，其中5例患者死亡：低心排綜合征2例、腎功能衰竭2例、肺部感染1例。在其余173例未發(fā)生AKI的患者中，選取年齡、性別、基礎(chǔ)合并癥、手術(shù)時(shí)間、手術(shù)類型等因素相匹配的35患者例為非AKI組。AKI組Scr較非AKI組顯著升高，兩組比較有顯著差異(P<0.05)，其中3例Scr升高峰值出現(xiàn)在術(shù)后12～24h內(nèi)，15例峰值出現(xiàn)在術(shù)后24～48 h內(nèi)，22例峰值出現(xiàn)在術(shù)后48～72 h內(nèi)，見圖1。

圖1 體外循環(huán)術(shù)后Scr變化

2.2 兩組尿Netrin-1/Ucr、NGAL/Ucr水平比較 兩組術(shù)前尿Netrin-1/Ucr及NGAL/Ucr基線水平比較無(wú)明顯差異 (P>0.05)。非AKI組CPB術(shù)后尿Netrin-1/Ucr及NGAL/Ucr水平輕度升高，與術(shù)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。 AKI組尿Netrin-1/Ucr水平在CPB術(shù)后2h內(nèi)開始明顯上升，術(shù)后3～12h升高達(dá)峰值，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)，此后開始下降，48～72h逐步降至基線水平。尿NGAL/Ucr水平在CPB術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)都明顯升高，以術(shù)后2～6h最為明顯，此后逐漸下降，但高水平濃度一直維持至術(shù)后72h，兩組比較有顯著性差異 (P<0.05)，見圖 2、3。

圖2 體外循環(huán)術(shù)后尿Netrin-1/Ucr水平變化

圖3 體外循環(huán)術(shù)后尿NGAL/Ucr水平變化

2.3 尿Netrin-1、NGAL在AKI早期診斷中的價(jià)值A(chǔ)KI組尿Netrin-1及NGAL在CPB術(shù)后2h即明顯上升，而Scr大多數(shù)在CPB術(shù)后24 h才開始顯著升高，如依據(jù)Scr水平診斷AKI，只能在CPB后24～72 h才可做出判斷。術(shù)后2h Netrin-1的ROC曲線下面積為0.906，在Cutoff值為150ng/mgCr時(shí)，尿Netrin-1診斷AKI的敏感性和特異性分別為88.2%和87.6%。術(shù)后2h NGAL的ROC曲線下面積為 0.901， 在 Cutoff值為 100μg/mgCr時(shí)，尿NAGL診斷AKI的敏感性和特異性分別為87.8%和86.5%，兩者聯(lián)合檢測(cè)，在AKI診斷中的敏感性和特異性進(jìn)一步提高，分別為92.6%和91.5%，ROC曲線下面積為0.958，可提高AKI早期診斷的敏感性和特異性，見圖4。

圖4 術(shù)后2h尿Netrin+及NGAL的ROC曲線分析

3 討論

AKI是CPB心臟手直視手術(shù)后常見嚴(yán)重的并發(fā)癥，不僅增加住院時(shí)間和住院費(fèi)用，還明顯增加術(shù)后患者的死亡率，直接影響患者的預(yù)后。目前，CPB術(shù)后發(fā)生AKI的機(jī)制還未完全闡明，早期診斷和干預(yù)可改善患者預(yù)后，降低死亡率，但目前臨床還缺乏敏感、特異早期診斷AKI的指標(biāo)，因此尋找新的早期診斷AKI的生物學(xué)標(biāo)志已成為目前的研究熱點(diǎn)。

目前，Scr水平仍是臨床診斷急性腎功能衰竭的主要依據(jù)，但大量研究表明，Scr變化較慢且缺乏特異性[6]。Netrin-1是近年發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于包括腎臟在內(nèi)多種器官的一種層粘連蛋白樣分子，屬于Netrin家族，在神經(jīng)細(xì)胞遷移和軸突導(dǎo)向活動(dòng)中具有重要的作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Netrin-1可能通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)損傷的腎小管上皮細(xì)胞增殖和修復(fù)而對(duì)腎臟起保護(hù)作用，AKI時(shí)Netrin-1短時(shí)間內(nèi)強(qiáng)烈表達(dá)并分泌于尿液中[7,8]。NGAL屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族，是一種調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞凋亡的蛋白分子，正常情況下低水平表達(dá)于人體的多個(gè)組織臟器，腎缺血后NGAL基因明顯上調(diào)，引發(fā)NGAL蛋白分子過度表達(dá)[9]。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明[3,4,10]，多種病因致腎損傷時(shí)，血和尿NGAL水平顯著增加，數(shù)小時(shí)內(nèi)便可在尿液中檢測(cè)到。本研究中18.8%的患者CPB術(shù)后3d內(nèi)發(fā)生不同程度 AKI，3例 Scr升高峰值出現(xiàn)在術(shù)后 12～24h，15 例出現(xiàn)在術(shù)后 24～48h，22 例出現(xiàn)在術(shù)后48～72h，如以Scr水平診斷AKI要延遲到術(shù)后2～3d，以此來(lái)指導(dǎo)治療，可能會(huì)喪失最佳治療時(shí)機(jī)。而AKI組尿Netrin-1和NGAL在CPB術(shù)后2h均明顯升高，Netrin-1高水平持續(xù)至術(shù)后48h，在48～72h后逐步降至正常水平，而NGAL在術(shù)后72h內(nèi)仍維持在高濃度水平，與未發(fā)生AKI組比較有顯著差異。

ROC曲線下面積是目前普遍公認(rèn)的診斷試驗(yàn)真實(shí)性評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性指標(biāo)，曲線下面積值越接近1.0診斷效果越理想。從本研究ROC曲線分析看，術(shù)后2hNetrin-1的ROC曲線下面積為0.906，在Cutoff值為150ng/mgCr時(shí)，尿Netrin-1診斷AKI的敏感性和特異性分別為88.2%和87.6%，因此，檢測(cè)尿Netrin-1可能有助AKI的早期診斷，與Ramesh等[8]的報(bào)道基本一致；NGAL的ROC曲線下面積為0.901，在Cutoff值為100μg/mgCr時(shí)，尿NAGL診斷AKI的敏感性和特異性分別為87.8%和86.5%，與趙京生等[3]的報(bào)道基本一致。本研究中，尿Netrin-1與NGAL兩者ROC曲線下面積均在0.9以上，對(duì)AKI均顯示了較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，可以作為CPB術(shù)后早期診斷AKI兩種敏感性和特異性較高的生物學(xué)標(biāo)志物。兩者聯(lián)合檢測(cè)，在AKI診斷中的敏感性和特異性分別為92.6%和91.5%，ROC曲線下面積為0.958，可提高AKI早期診斷效果。

本研究表明，尿Netrin-1與NGAL均可作為CPB術(shù)后AKI的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)，診斷AKI較Scr明顯提前，有利于早期對(duì)AKI進(jìn)行預(yù)防和干預(yù)。但CPB術(shù)后AKI發(fā)生的病理生理機(jī)制比較復(fù)雜，目前尚未完全明確，單一的生物標(biāo)志物尚達(dá)不到早期和快速的診斷，因此可能需要多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)以便達(dá)到更好的早期診斷效果。Netrin-1作為新的早期診斷AKI生物標(biāo)志物目前國(guó)內(nèi)研究很少，本研究為單中心小樣本非隨機(jī)對(duì)照研究，存在較多不足之處，因此，需要更大樣本的多中心隨機(jī)對(duì)照研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證尿Netrin-1在CPB術(shù)后AKI早期診斷中的價(jià)值。

[1]凌光輝,曾妮,劉家軍,等.5100例CPB心臟手術(shù)后急性腎損傷的圍手術(shù)期危險(xiǎn)困素分析[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,34(9):861-866．

[2]Coea SG,Yalavarthy B,Concato J,et a1.Biomarkers for the diagnosis and risk stratification of acute kidney injury:a systematic review[J].Kidney Int,2008,73(7):1008-1016.

[3]趙京生,吳鐵軍,易偉國(guó),等.尿NGAL在CPB術(shù)后急性腎損傷早期診斷中的意義[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2010,12(11):471-1473.

[4]車妙琳,錢家麒,戴慧莉.等.尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在成人心臟手術(shù)后急性腎損傷早期診斷中的價(jià)值[J].中華腎臟病雜志,2009,25(5):350-355.

[5]Coca SG,Yalavarthy R,Coneato J,et a1.Biomarkers for tlle diagnosis and risk stratification of acute kidney injury:A systematic review[J].Kidney Int,2008,73(6):1008-1016.

[6]Koyner J,Bennett MR,Worcester EM,el a1.Urinary cystatin C as an early biomarker of acute kidney injury following adult cardiothoracic sufgery[J].Kidney Int,2008,74(8):1059-1069.

[7]Wang W,Reeves WB,Pays L,et a1.Netrin-1 overexpression protects kidney from ischemia reperfusion injury by suppressing apoptosis[J].Am J Pathol,2009,175(10):1010-1018.

[8]Ramesh G,Kwon O,Ahn K.Netrin-1:a novel universal biomarker of human kidney injury[J].Transplant Proc,2010,42(8):1519-1522.

[9]Moil K,Lee HT,Rapoport D,el a1.Endoeytic delivery of lipocalinside rophore-iron complex rescues the kidney from ischemia reperfusion injury[J].J Clin nvest,2005,115(3):610-621.

[10]Han WK,Wagener B,Zhu YQ,el a1.Urinary biomarkers in the early detection of acute kidney injury after cardiac surgery[J].Clin J Am Soc Nephrol,2009,4(5):873-882.