糖尿病對大鼠肝纖維化組織TIMP－1／MMP－1表達(dá)的影響＊

陳 楓，楊愛萍，李 燕，史小玲，唐小平，唐 莉，王曉燕，陳 莊△

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州 730030）

糖尿病是以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群。中國糖尿病和糖尿病前期患病率分別高達(dá)9.7%和15.5%［1］。持續(xù)性高血糖對許多臟器如腎臟、心腦血管纖維化具有明顯促進(jìn)作用，與肝臟纖維化的關(guān)系也在研究之中［2－3］。但其機(jī)制未能完全闡明。肝細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）分解代謝平衡主要是由TIMPs／MMPs系統(tǒng)調(diào)控，其中金屬蛋白酶組 織 抑 制 劑－1 （tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1）／金 屬 基 質(zhì) 蛋 白 酶－1 （matrix metalloproteinase－1，MMP－1）的變化更能準(zhǔn)確反映肝臟中ECM的合成和降解情況［4］。為了更好地分析高血糖對肝纖維化的影響，TIMP－1／MMP－1系統(tǒng)在糖尿病相關(guān)性肝纖維化中的作用，現(xiàn)將糖尿病對大鼠肝纖維化組織TIMP－1／MMP－1表達(dá)的影響報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司）；檸檬酸、檸檬酸三鈉（上海前塵生物公司）；四氯化碳（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型膠原蛋白（collagen typeⅣ，C－Ⅳ）和Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PⅢNP）試劑（鄭州安圖生物公司）；總RNA試劑盒（北京天根生化公司）；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0，SYBR Premix Ex TaqⅡ（大連寶生物公司）；MMP－1、TIMP－1、β－actin RT－PCR擴(kuò)增引物（上海生工合成，引物序列見表1）；微量血糖測定儀，血糖試紙（美國強(qiáng)生公司）。pH4.5的檸檬酸緩沖液配制：A液0.1mol／L的檸檬酸；B液0.1mol／L的檸檬酸三鈉，A∶B＝1∶1.32（用前配制）；1%STZ溶液配制：稱所需質(zhì)量的STZ，溶于其相應(yīng)體積的pH4.5的檸檬酸緩沖液中（腹腔注射前溶解）。

表1 RT－PCR基因及引物序列

1.2 動(dòng)物模型 清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，共40只，購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病組、肝纖維化組、糖尿病肝纖維化組（雙模型組），各10只。實(shí)驗(yàn)前大鼠尾尖采血，測定血糖值，正常大鼠方可用于試驗(yàn)。正常對照組：腹腔注射同體積的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液和花生油溶液。糖尿病組：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾尖采血，測定血糖大于16.7mmol／L為糖尿病模型大鼠［5］。肝纖維化組：皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次劑量0.4mL／kg，以后每隔3天注射0.2mL／kg。雙模型組：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾靜脈采血，測定血糖，7d后重復(fù)測定血糖，血糖大于16.7mmol／L的大鼠皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次劑量0.4mL／kg，以后每隔3天皮下注射0.2mL／kg，8周末腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，處死各組大鼠。心臟取血、剖腹取肝組織。

1.3 指標(biāo)檢測 全自動(dòng)生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alaniine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotran－sferase，AST）、血漿清蛋白（albumin，ALB）和清蛋白／球蛋白（A／G）。化學(xué)發(fā)光法測定 HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ。RT－PCR（SYBR Green相對定量法）檢測肝臟組織α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、MMP－1和TIMP－1表達(dá)。取肝臟組織50mg磨碎，提取總RNA，制備cDNA模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：MgCl22μL、10RT Buffer 1μL、dNTP Mixture 1μL、RNase Inhibittor 0.25μL、AMV Reverse Transriptase 0.5μL、Oligo dT－Adaptor Primer 0.5μL、RNase Free d H2O 3.75μL、樣品RNA 1μL、Total volume 5μL。30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。

RT－PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dH2O 8.5μL、樣品RNA 2μL、Total volume 25μL。95℃30s，95℃5s，59.5℃10s，檢測實(shí)時(shí)熒光，共40個(gè)循環(huán)；65～95℃生成融解曲線，每個(gè)步驟10s，＋0.5℃／循環(huán)并行實(shí)時(shí)熒光檢測，共60個(gè)循環(huán)。

病理檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，將大鼠處死，剖腹取肝臟，固定，脫水，石蠟包埋，VG染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示。對樣本數(shù)先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)用One－Way ANOVA檢驗(yàn)。方差不齊時(shí)用Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)比較總的差異，再用Mann－Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝功能指標(biāo) 與正常對照組比較，肝纖維化組和雙模型組ALT、AST濃度明顯升高，ALB、A／G明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組ALT、AST濃度明顯升高和ALB、A／G明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組ALT、AST升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 大鼠血清肝纖維化指標(biāo) 與正常對照組比較，肝纖維化組、雙模型組HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ 明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組HA、LN、PⅢNP、C－Ⅳ 明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組HA、C－Ⅳ升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 肝組織VG染色變化 正常對照組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序，未見脂肪變性、壞死，無膠原纖維增生；糖尿病組肝臟結(jié)構(gòu)基本正常，少量出現(xiàn)炎性壞死、脂肪變性；肝纖維化組肝細(xì)胞廣泛脂肪變性、壞死，炎性細(xì)胞浸潤，以匯管區(qū)及中央靜脈周圍較重。有纖維組織增生的情況，但未形成假小葉；雙模型組中大部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞索排列失去放射狀結(jié)構(gòu)，纖維結(jié)締組織增生形成寬窄不一的纖維條索，伸入肝實(shí)質(zhì)中，形成纖維間隔，包繞、分割正常肝組織，形成假小葉。見圖1和表4。

表2 4組大鼠肝功能指標(biāo)比較

表2 4組大鼠肝功能指標(biāo)比較

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n ALT（U／L） AST（U／L） ALB（g／L） A／G正常對照組 10 68.460±17.534 106.928±19.659 42.582±7.667 1.235±0.420糖尿病組 10 85.723±18.998 112.615±20.178 42.446±7.915 1.228±0.143肝纖維化組 10 171.532±17.415ab 175.518±23.711ab 32.046±9.982ab 0.711±0.312ab雙模型組 10 224.914±23.321abc 234.058±18.001abc 31.762±7.768ab 0.703±0.408ab

表3 4組大鼠肝纖維化指標(biāo)濃度的比較（ng／mL

表3 4組大鼠肝纖維化指標(biāo)濃度的比較（ng／mL

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n HA C－Ⅳ PⅢNP LN正常對照組 10 88.856±11.848 8.206±0.953 8.717±4.546 6.026±2.331糖尿病組 10 97.808±19.123 10.991±3.315 8.720±2.582 7.085±2.404肝纖維化組 10 194.892±14.594ab 16.223±3.217ab 15.122±5.335ab 10.561±1.319ab雙模型組 10 251.484±63.466abc 20.184±5.032abc 15.646±2.992ab 10.811±4.026ab

圖1 4組大鼠肝組織膠原纖維影像表現(xiàn)（VG染色，×100）

表4 4組大鼠纖維化分期和計(jì)分的比較）

表4 4組大鼠纖維化分期和計(jì)分的比較）

a：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n 分期（n）0 1 2 3 4 計(jì)分（分）正常對照組 10 10 0 0 0 0 0糖尿病組 10 10 0 0 0 0 0肝纖維化組 10 0 0 4 4 2 8.7±5.420雙模型組 10 0 0 2 4 4 13.6±6.813a

2.4 肝臟組織α－SMA、MMP－1和TIMP－1基因表達(dá) 與正常對照組比較，肝纖維化組和雙模型組α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表 達(dá) 升 高，差 異有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組和雙模型組α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組α－SMA和TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正 常 對 照 組 和 糖 尿 病 組 中 α－SMA、TIMP－1 及TIMP－1／MMP－1基因表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各組間MMP－1基因表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 4組大鼠肝臟組織中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表達(dá)水平的比較

表5 4組大鼠肝臟組織中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表達(dá)水平的比較

a：P＜0.05，與正常對照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n α－SMA TIMP－1 MMP－1 TIMP－1／MMP－1正常對照組 10 1.412±0.237 1.103±0.777 1.064±0.681 0.973±0.772糖尿病組 10 1.992±0.166 1.134±0.306 1.134±0.122 1.000±0.091肝纖維化組 10 3.285±0.054ab 3.816±0.887ab 1.488±0.421 2.561±0.307ab雙模型組 10 17.927±0.672abc 6.920±0.588abc 1.619±0.524 4.279±1.414abc

3 討 論

糖尿病與肝纖維化有密切關(guān)系，可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，增加肝硬化和肝癌的發(fā)生［6－8］。同時(shí)，慢性肝損傷也可以影響糖代謝，形成惡性循環(huán)，但其機(jī)制未能闡明。高血糖作為糖尿病的重要表現(xiàn)，是各型糖尿病的共同特征。本研究采用鏈尿佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病模型，通過破壞胰島β細(xì)胞，誘發(fā)大鼠形成糖尿病。四氯化碳是常用的中毒性肝纖維化誘導(dǎo)物，通過細(xì)胞色素氧化酶代謝為三氯甲基自由基從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死、凋亡［9］，反復(fù)刺激形成了炎癥細(xì)胞集聚、釋放細(xì)胞因子觸發(fā)間質(zhì)組織的過量膠原纖維產(chǎn)生肝纖維化。當(dāng)肝纖維發(fā)生時(shí)，細(xì)胞中ALT、AST釋放于血清是肝細(xì)胞炎癥和壞死的血清學(xué)指標(biāo)；ALB、A／G是肝細(xì)胞合成代謝功能的指標(biāo)，其降低程度與肝臟合成功能損害程度呈正比。ECM主要由膠原蛋白、LN、HA等成分組成，所以，ECM及其代謝產(chǎn)物是研究血清標(biāo)志物的首選。目前，HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ為常見的臨床檢測肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，同時(shí)酶促化學(xué)發(fā)光法檢測具有密度好、準(zhǔn)確性高、溶血對檢測干擾少等優(yōu)點(diǎn)［10－11］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組與正常對照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)沒有顯著區(qū)別，表明早期糖尿病對肝臟功能影響較小。肝纖維化組中，ALT、AST、HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ濃度高于正常對照組和糖尿病組，ALB、A／G明顯降低（P＜0.05），加之病理改變，證實(shí)造模成功。雙模型組與肝纖維化組比較，ALT、AST、HA和C－Ⅳ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），雙模型組是肝纖維化模型加糖尿病模型，說明糖尿病加重了肝臟纖維化程度，促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)展。其結(jié)果也與組織切片VG染色結(jié)果相符合，在大鼠纖維化分期和計(jì)分的比較中，雙模型組與肝纖維化組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

肝纖維化是各種慢性肝病的病理特征，其發(fā)生機(jī)制是ECM過度增生和異常沉積。研究表明，肝纖維化發(fā)生中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活和增殖。當(dāng)各種因素引起HSC激活后，HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞并特異性表達(dá)α－SMA，主要表達(dá)于HSC胞核，說明α－SMA是HSC激活標(biāo)志，進(jìn)而成為提示肝纖維化病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［12］。通過RT－PCR結(jié)果觀察到，與正常對照組和糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組α－SMA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組α－SMA的表達(dá)升高（P＜0.05）。這與方瑜潔等［13］的研究結(jié)果一致，提示高血糖可以促進(jìn)肝臟HSC活化、增殖，從而加重大鼠肝纖維化的程度。因此，HSC激活在糖尿病相關(guān)性肝纖維化的形成過程中可能起著重要的促進(jìn)作用。Sugimoto等［14］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高血糖可以引起HSC增生和Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，提示高血糖是促進(jìn)肝纖維化發(fā)展的重要因素。其他體外實(shí)驗(yàn)也觀察到，不同高濃度的葡萄糖均能刺激HSC并導(dǎo)致HSC增殖，且DNA合成呈劑量依賴性［15］。所以，糖尿病持續(xù)性高血糖對肝纖維化的影響可能是通過激活HSC和增加膠原ECM的產(chǎn)生，進(jìn)而加重肝纖維化。

肝纖維化的產(chǎn)生是由于MMPs活性下降和（或）TIMPs活性升高導(dǎo)致ECM的合成和降解的失衡，從而出現(xiàn)ECM在肝內(nèi)過度沉積。MMPs是一組鋅離子依賴酶，它對于ECM中細(xì)胞外大分子如膠原具有降解作用，因此，是調(diào)節(jié)ECM動(dòng)態(tài)平衡最重要的一大酶系［16］；TIMPs是一組有抑制MMPs功能的活性多肽，與等比例的MMPs以共價(jià)鍵可逆結(jié)和形成復(fù)合體，從而抑制MMPs的活性。所以，TIMPs／MMPs系統(tǒng)在維持肝臟中ECM平衡起著重要作用。MMP－1是MMPs家族的一員，主要降解ECM中的Ⅰ、Ⅲ型膠原［17］，MMP－1的活性主要受特異性抑制物TIMP－1的調(diào)節(jié)。有研究表明，在肝纖維化發(fā)展過程中，TIMP－1的表達(dá)增強(qiáng)，TIMP－1／MMP－1的比值升高，使ECM降解減少，增加了膠原纖維的積累并促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，是肝纖維化形成的重要因素［18］。因此，TIMP－1／MMP－1比值的改變更能準(zhǔn)確地反映肝臟中ECM合成和降解的情況［4］。本研究結(jié)果表明，與正常對照組和糖尿病組相比，肝纖維化組中TIMP－1表達(dá)增加、MMP－1變化不明顯，從而引起的TIMP－1／MMP－1改變導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，與文獻(xiàn)［19］一致。與肝纖維化組比較，雙模型組 TIMP－1、TIMP－1／MMP－1表達(dá)升高（P＜0.05），由此說明高血糖狀態(tài)下大鼠肝纖維化程度加重與TIMP－1表達(dá)增加相關(guān)，而不是 MMP－1表達(dá)減少，所以，TIMP－1／MMP－1失衡加劇了ECM的形成。糖尿病持續(xù)性高血糖影響TIMP－1／MMP－1系統(tǒng)的平衡，其可能的機(jī)制：高血糖激活了HSC的表達(dá)，激活的HSC釋放大量的TIMP－1，從而導(dǎo)致了TIMP－1／MMP－1失衡。其可能的機(jī)制還有高血糖狀態(tài)可能分泌大量 TNF－α、IL－1等炎癥介質(zhì)［20］，它們可以進(jìn)一步刺激 HSC 增 殖，影 響 TIMP－1／MMP－1的 平 衡。Wakisaka等［21］研究認(rèn)為，在高血糖情況下，ECM成分的改變會(huì)影響MMPs的表達(dá)。正常情況下，ECM中的正常成分通常作為ECM分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號。在血糖高的情況下，這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，影響了TIMP－1／MMP－1正常表達(dá)和形成ECM的沉積。

因此，糖尿病加重肝纖維化發(fā)生的機(jī)制與TIMP－1／MMP－1的失衡有密切關(guān)系。深入研究糖尿病肝纖維化過程中HSC激活和TIMP－1／MMP－1調(diào)節(jié)性失衡異常的機(jī)制，可以更好地闡明糖尿病相關(guān)性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，為臨床上防治糖尿病相關(guān)性肝纖維提供新的思路和治療方法。

［1］ Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362（12）：1090－1101.

［2］ Nathan DM，Buse JB，Davidson MB，et al.Medical management of hyperglycemia in type 2diabetes：a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy：a consensus statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes［J］.Diabetes Care，2009，32（1）：193－203.

［3］ Hickman IJ，Macdonald GA.Impact of diabetes on the severity of liver disease［J］.Am J Med，2007，120（10）：829－834.

［4］ Arthur MJ，Mann DA，Iredale JP.Tissue inhibitors of metalloproteinases，hepatic stellate cells and lever fibrosis［J］.J Gastronenol Hepatal，1998，13（Suppl）：S33.

［5］ 陳楓，程錦楠，唐小平，等.大鼠品系藥物劑量對糖尿病大鼠模型的影響［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34（2）：156－158.

［6］ 曾民德，王秦齡，王寶恩.肝纖維化診斷及療效評估共識(shí)［J］.中華肝臟病雜志，2002，10（5）：327－328.

［7］ Moscatiello S，Manini R，Marchesini G.Diabetes and liver disease：an ominous association［J］.Nutr Matab Cardiovasc Dis，2007，17（1）：13－20.

［8］ Garcia－Compean D，Jaquez－Quintana JO，Maldonado－Garza H.Hepatogenous diabetes：current views of an ancient problem［J］.Ann Hepatol，2009，8（1）：13－20.

［9］ Chobert MN，Couchie D，F(xiàn)ourcot A，et al.Liver precursor cells increase hepatic fibrosis induced by chronic carbon tetrachloride intoxication in rats［J］.Lab Invest，2012，92（1）：135－150.

［10］Zeng MD，Lu LG，Mao YM，et al.Prediction of significant fibrosis in HBeAg－positive patients with chronic hepatitis B by a noninvasive model［J］.Hepatology，2005，42（6）：1437－1445.

［11］雷震，謝南，溫麗麗，等.化學(xué)發(fā)光法檢測血清肝纖維化指標(biāo)評價(jià)［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，27（6）：672－674.

［12］Chen YW，Lid G，Wu JX，et al.Tetrandrine inhibits the activation of rat hepatic stellate cells via up－regulation of Smad 7［J］.Chem Pharmacol Bull，2005，21（5）：563－567.

［13］方瑜潔，萇新明.高血糖對肝纖維化大鼠肝組織α－SMA和CTGF表達(dá)的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11（7）：1－4.

［14］Sugimoto R，Enjoji M，Kohjima M，et al.High glucose stimulates hepatic stellate cells to proliferate and to produce collagen through free radical production and activation of mitogen－activated protein kinase［J］.Liver Int，2005，25（5）：1018－1026.

［15］李芹，鄧存良，陳莊，等.高糖、胰島素對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（11）：1669－1672.

［16］Veidal SS，Karsdal MA，Vassiliadis E，et al.MMP mediated degradation of typeⅥcollagen is highly associated with liver fibrosis－－identification and validation of a novel biochemical marker assay［J］.PLoS One，2011，6（9）：e24753.

［17］Iimuro Y，Brenner DA.Matrix metalloproteinase gene delivery for liver fibrosis［J］.Pharm Res，2008，25（2）：249－258.

［18］Hemmann S，Graf J，Roderfeld M，et al.Expression of MMPs and TIMPs in liver fibrosis－a systematic review with special emphasis on anti－fibrotic strategies［J］.J Hepatol，2007，46（5）：955－975.

［19］Nie QH，Duan GR，Lao XD，et al.Expression of TIMP－Ⅰand TIMP－2in rats with hepatic fibrosis［J］.World J Gastroenterol，2004，10（1）：86－90.

［20］Sun X，Han F，Yi J，et al.Effect of aspirin on the expression of hepatocyte NF－κB and serum TNF－αin streptozotocin－induced type 2diabetic rats［J］.J Korean Med Sci，2011，26（6）：765－770.

［21］Wakisaka M，Spiro MJ，Spiro RG.Synthesis of type Ⅵcollagen by cultured glomerular cells and comparison of its regulation by glucose and other factors with that of typeⅣ collagen［J］.Diabetes，1994，43（1）：95－103.