ELISA檢測唾液中乙型肝炎表面抗原方法的優(yōu)化與評價

張 進

（上?；瘜W工業(yè)區(qū)醫(yī)療中心 200000）

中國是乙型病毒肝炎（HBsAg）的高發(fā)國家，根據流行病學調查，人群發(fā)生率較高。表面抗原攜帶率約為15%［1］。乙型肝炎的實驗診斷對于其治療及預防有重要參考意義。目前，中國大多數臨床實驗室都采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法來檢測HBsAg，而檢測樣品大多數均為血清。抽取靜脈血檢驗，受檢者痛苦，且操作步驟繁瑣，費時費力，存在一定風險，并不利于乙型肝炎疾病長期臨床的檢驗監(jiān)測。有相關研究報道，唾液中可以檢測到乙型肝炎病毒［2］。然而，國內并沒有特別針對唾液樣品的商品化試劑盒。雖國內有相關研究報道，但方法條件不一，且特異度和敏感度均偏低。因此，本研究以唾液為樣品，對ELISA條件進行優(yōu)化，并對改進后的方法進行評價。

1 資料與方法

1.1 一般資料 47例HBsAg血清陽性樣本均來自本院住院和門診患者，其中，男27例，女20例，年齡18～67歲，平均（40±12）歲。HBsAg血清陰性健康對照68例，均為來本院健康體檢人員，其中，男36例，女32例，年齡22～56歲，平均（38±8）歲，無乙型肝炎病毒感染史。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 購自上?？迫A公司，均在有效期內使用。

1.3 取樣 受檢者靜脈采血2mL，分離血清，存于－20℃待檢。同時囑被檢者隨機吐唾液3mL，存于－20℃待檢。

1.4 檢測方法 血清檢測具體方法嚴格按上?？迫A公司提供的說明書進行。唾液檢測具體方法除以下幾點外，均按說明書進行，（1）樣品類型：①未處理樣本，1mL唾液樣本直接用于檢測；②樣本上清，將2mL唾液樣本12 000r／min離心5min取上清；③樣本沉淀，將上述離心后的沉淀用2mL蒸餾水重懸。（2）加樣體積：50、100、150μL。（3）樣品孵育條件：37 ℃，90 min；25℃，18h。

1.5 臨界值（cut－off value，CO）計算方法 方法1：CO1＝陰性對照OD450均值／3；方法2：CO2＝陰性對照 OD450均值＋3SD；方法3：使用 MedCalc統(tǒng)計軟件（version 9.2.1.0），利用ROC曲線計算曲線下面積（AUROC），判斷最優(yōu)臨界值CO3。

1.6 統(tǒng)計學處理 血清樣品的HBsAg檢測結果作為評價優(yōu)化后ELISA方法用于檢測唾液樣品HBsAg的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值的標準。計量資料采用表示，絕對變量比較采用χ2檢驗；非絕對變量比較采用 Mann－Whitney U檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。唾液和血清檢測結果的一致性用κ指數評估。

2 結 果

陽性血清樣品的平均吸光值（OD450）為2.274±1.453，陰性血清樣品的平均吸光值（OD450）為0.017±0.026。未處理樣本、樣本上清和樣本沉淀這3種不同類型的樣品檢測結果比較差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.100），結果如圖1所示。因此，不做任何處理的唾液樣品可直接用于檢測。不同加樣體積檢測結果比較差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.070），結果如圖2所示。因此，加樣體積定為50μL。對50μL不做處理的唾液樣品在2種ELISA孵育條件（溫度、時間）下的檢測結果進行分析，發(fā)現25℃孵育18h條件下的檢測結果與對應血清檢測結果極為相似，而37℃孵育2h條件下的檢測結果與血清檢測結果差異顯著（P＝0.003），見圖3。

圖1 未處理樣本、樣本上清和樣本沉淀的檢測結果

由于目前暫無用于檢測唾液中HBsAg的商業(yè)化試劑盒，且唾液檢測在國內醫(yī)院中并不常用，所以臨界值（cut－off value）的計算并沒有標準方法。因此，通過對3種不同的臨界值計算方法進行評估，結果顯示ROC法（CO3）最合適，臨界值為0.098。采用該方法后，精確度、陽性預測值和陰性預測值均得到提高，分別達到93.0%、89.9%和95.4%，結果見表1。

根據以上實驗結果，選取50μL不做任何處理的唾液樣品，采用25℃孵育18h的孵育條件進行檢測，結果按照ROC曲線法判定。通過上述優(yōu)化后的ELLSA方法檢測，47例血清陽性對應的唾液樣品中，44例為陽性；68例血清陰性對應的唾液樣品中，63例為陰性。該優(yōu)化方法檢測唾液中HBsAg結果與對應血清樣品結果見圖4?？傊搴屯僖簶悠窓z測結果的一致性比較高，κ指數為0.87。且該方法的特異度和敏感度分別為92.6%和93.6%。

圖2 3種不同加樣體積的檢測結果

圖3 37℃孵育2h和25℃孵育18h兩種孵育條件處理的檢測結果

表1 3種臨界值計算方法的敏感度、精確度、陽性預測值、陰性預測值和精確度

圖4 優(yōu)化后ELISA法檢測唾液中HBsAg結果與對應血清樣品結果比較

3 討 論

唾液用于多種傳染病的抗體或抗原檢測具有方便性。有報道顯示，HBV攜帶者的唾液可能具有潛在的傳染性［3］。近年來有大量研究致力于唾液中肝炎病毒標志物檢測方法的開發(fā)和優(yōu)化［4－6］。唾液取樣具有簡單、快捷、低成本等優(yōu)點。因此，在部分血清流行病學檢測中，唾液取代血清作為檢測樣品將產生巨大的社會效益和經濟效益［7］。本研究主要對ELISA檢測唾液中乙型肝炎表面抗原的方法進行了優(yōu)化和評價。研究中發(fā)現，個別唾液檢測結果為陰性的樣品，對應的血清檢測結果卻為陽性。這可能是由于該唾液樣品中HBV抗原濃度太低的原因。同時，作者還發(fā)現這些陽性血清樣品中HBsAg濃度很高（OD450＞3.0），表明唾液中 HBsAg濃度與血清中HBsAg濃度之間并無顯著相關性，該原因仍需進一步研究。

由于目前暫無用于檢測唾液中HBsAg的商業(yè)化試劑盒，且唾液檢測在國內醫(yī)院中并不常用，所以臨界值（cut－off value）的計算并沒有標準方法。3種不同的臨界值計算方法在其他研究中均有成功的報道［8－11］。因此，本研究對此3種方法進行評價，結果顯示AUROC分析法最為合理，可得到較高的敏感度和特異度。通過對其他條件（樣品類型、加樣體積、孵育溫度和時間）進行優(yōu)化，最終使該方法的精確度達到93%。

［1］ 王萍.中國乙型肝炎的流行及疫苗研究［J］.醫(yī)學動物防治，2012，28（8）：872－874.

［2］ 吳曉蔓，馮秀蘭，周利純.乙肝病毒攜帶產婦乳汁、唾液乙肝病毒標志物檢測結果分析［J］.中國婦幼保健，2009，24（8）：1036－1038.

［3］ 張健，竇翠云，李曉哲，等.乙型肝炎患者唾液中HBV－M與HBV DNA的相關性研究［J］.中國誤診學雜志，2007，7（2）：209－211.

［4］ Heiberg IL，Hoegh M，Ladelund S，et al.Hepatitis B virus DNA in saliva from children with chronic hepatitis B infection：implications for saliva as a potential mode of horizontal transmission［J］.Pediatr Infect Dis J，2010，29（5）：465－467.

［5］ Hutse V，Verhaegen E，De Cock L，et al.Oral fluid as a medium for the detection of Hepatitis B surface antigen［J］.J Med Virol，2005，77（1）：53－56.

［6］ Amado LA，Villar LM，De Paula VS，et al.Comparison between serum and saliva for the detection of hepatitis A virus RNA［J］.J Virol Methods，2008，148（1／2）：74－80.

［7］ 黃晨艷，方衣兵，蔡娟，等.圍生期產婦血清、乳汁、唾液乙肝病毒標志物間的關聯(lián)性［J］.中國婦幼保健，2006，26（26）：4081－4084.

［8］Judd A，Parry J，Hickman M，et al.Evaluation of a modified commercial assay in detecting antibody to hepatitis C virus in oral fluids and dried blood spots［J］.J Med Virol，2003，71（1）：49－55.

［9］ Cruz HM，da Silva EF，Villela－Nogueira CA，et al.Evaluation of saliva specimens as an alternative sampling method to detect hepatitis B surface antigen［J］.J Clin Lab Anal，2011，25（2）：134－141.

［10］Ljungdahl M，Montgomerie C，Gyan BA，et al.Screening for HIV and hepatitis C virus using saliva tests in a prison in Ghana.a study of the prevalence and the status of knowledge［J］.Lakartidningen，2012，109（4）：161－163.

［11］Arora G，Sheikh S，Pallagatti S，et al.Saliva as a tool in the detection of hepatitis B surface antigen in patients［J］.Compend Contin Educ Dent，2012，33（3）：174－176.