妊娠期糖代謝異常與CAPN－10基因多態(tài)性及相關(guān)危險(xiǎn)因素研究＊

周 龍，費(fèi) 櫻，馬 莉，譚玉潔，3△

（1.重慶三峽中心醫(yī)院生化科，重慶 萬(wàn)州 404000；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550001；3.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬白云醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽(yáng) 550014）

妊娠期糖代謝異常包括妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）和妊娠期糖耐量受損（gestational impaired glucose tolerance，GIGT）。有關(guān)研究資料表明，GDM與GIGT的總體發(fā)病率逐年升高，達(dá)7.6%［1］，其發(fā)生與遺傳、環(huán)境及生活習(xí)慣密切相關(guān)，但發(fā)病機(jī)制和病因至今還在研究之中。Hanis等［2］首次報(bào)道了CAPN－10基因與2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）連鎖不平衡。國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛對(duì)CAPN－10基因與糖尿病的關(guān)系展開(kāi)研究。目前，同時(shí)對(duì)GIGT、GDM與CAPN－10基因以及相關(guān)危險(xiǎn)因素的報(bào)道較少。本文就貴陽(yáng)地區(qū)漢族GDM、GIGT患者的CAPN－10基因19、43及63位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行研究，并探討與糖代謝異常發(fā)生相關(guān)的因素，以期為GDM、GIGT的發(fā)病機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2009年10月至2010年11月在貴陽(yáng)市婦幼保健院及貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門(mén)診就診的孕婦，排除有孕前糖尿病史、慢性高血壓、內(nèi)分泌疾病、結(jié)締組織疾病、慢性肝病等系統(tǒng)性疾病，以及長(zhǎng)期使用類(lèi)固醇激素者，行50g葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)（glucose challenge test，GCT）及75g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）。采用相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)將受試者分為糖耐量正常（normal glucose tolerance，NGT）組、GIGT組和GDM組，每組100例，均為漢族，年齡在25～35歲之間，對(duì)每位孕婦進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，建立臨床資料，包括年齡、身高、體質(zhì)量、受教育程度、孕次、自然流產(chǎn)次數(shù)、孕前體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI，BMI＝體質(zhì)量／身高2）、孕期體質(zhì)量指數(shù)、孕期體質(zhì)量指數(shù)的變化（即△BMI＝體質(zhì)量的變化／身高2）、有無(wú)糖尿病家族史等。研究對(duì)象均符合倫理學(xué)要求，經(jīng)孕婦本人知情同意。

1.2 篩查程序及診斷標(biāo)準(zhǔn) GCT以口服50g葡萄糖后1h血糖大于7.8mmol／L為異常，對(duì)異常者做OGTT試驗(yàn)，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖。根據(jù)樂(lè)杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》第6版教科書(shū)標(biāo)準(zhǔn)，空腹12h后，口服葡萄糖75g，測(cè)空腹血糖（fasting plasma－glucose，F(xiàn)PG）及服糖后1、2、3h共4個(gè)時(shí)點(diǎn)的血糖即2h血糖（two hour plasma－glucose，2h－PG），正常值分別為5.6、10.3、8.6、6.7mmol／L，其中有2項(xiàng)或者2項(xiàng)以上超過(guò)正常值可診斷為GDM，1項(xiàng)異常者診斷為GIGT。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA提取方法 采用用酚－氯仿法提取基因組DNA，并測(cè)定DNA的純度和濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CAPN－10基因19、43及63位點(diǎn)基因型分析 （1）PCR引物序列：引物設(shè)計(jì)應(yīng)用primer premier 5軟件，由北京賽百盛公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系25μL，其中 Taq DNA 酶2.5U、dNTPs 2mmol／L、PCR 染料2.5 μL、10×PCR Buffer（含 Mg2＋）2.5μL、上下游引物各10pmol及模板DNA 100ng。（2）PCR反應(yīng)條件：19位點(diǎn)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min；43、63位點(diǎn)退火溫度分別為59℃、64.5℃，其他同上。（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：取上述PCR產(chǎn)物5μL，于3%瓊脂糖凝膠電泳后，在DNA成像分析儀下觀察目的條帶的位置。（4）CAPN－10基因的多態(tài)性檢測(cè)分析：19位點(diǎn)多態(tài)性是32bp的2次或3次重復(fù)多態(tài)性，其PCR產(chǎn)物可直接電泳分為3個(gè)基因型，即22純合子（404bp）、12雜合子（372 bp和404bp）、11純合子（372bp）；SNP 43、63多態(tài)性檢測(cè)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR－RFLP）方法。SNP 43位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)NsiI內(nèi)切酶37℃水浴6h酶切成121bp和23bp的2個(gè)片段，電泳后可出現(xiàn)GG型（144 bp）、GA型（144、121、23bp）和 AA型（121、23bp）3種基因型。SNP 63位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)HhaI內(nèi)切酶37℃水浴6h酶切成162bp和30bp的2個(gè)片段，電泳后可出現(xiàn)TT型（192 bp）、CT型（192、162、30bp）和CC型（162、30bp）3種基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)各位點(diǎn)基因頻率在群體中的代表性；計(jì)量資料的兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以表示；各組之間基因型和等位基因的分布差異采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用單因素和多因素Logistic回歸分析疾病發(fā)生的相關(guān)因素。

2 結(jié) 果

2.1 遺傳平衡定律檢驗(yàn) CAPN－10基因19、43、63位點(diǎn)的基因型頻率經(jīng)Hardy－Weinberg定律檢驗(yàn)，均符合遺傳平衡法則，表明各基因頻率滿(mǎn)足遺傳平衡（P＞0.05），等位基因的分布具有群體代表性。

2.2 研究對(duì)象的臨床特征 與NGT組比較，GIGT組的孕期BMI、△BMI、FPG及2h－PG均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GDM 組的年齡、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、FPG及2h－PG均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1；與GIGT組比較，GDM組的FPG、2h－PG均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 CAPN－10基因19、43、63位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布

2.3.1 CAPN－10基因19位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布與NGT組比較，GIGT、GDM組基因型及等位基因頻率的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GIGT與GDM組的基因型頻率、等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。提示CAPN－10基因19位點(diǎn)的長(zhǎng)度多態(tài)性可能與GIGT、GDM的發(fā)病無(wú)關(guān)。

表1 研究對(duì)象的臨床特征

表2 CAPN－10基因19位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布

表3 CAPN－10基因43位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布

表4 CAPN－10基因63位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布

2.3.2 CAPN－10基因43位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布GG基因型頻率在GDM組較NGT組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；G等位基因頻率在GDM組較NGT組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GIGT組與GDM組比較，其基因型頻率、等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.3.3 CAPN－10基因63位點(diǎn)基因型、等位基因頻率分布在NGT、GIGT和GDM組間兩兩比較，其基因型頻率、等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。提示CAPN－10基因SNP 63位點(diǎn)可能與GIGT、GDM的發(fā)病無(wú)關(guān)。

圖1 NGT組、GIGT組及GDM組的孕前BMI、孕期BMI及△BMI比較

2.4 妊娠期糖代謝異常的相關(guān)危險(xiǎn)因素分析

2.4.1 單因素Logistic回歸分析 對(duì)納入觀察的年齡、身高、體質(zhì)量、受教育程度、FPG、2h－PG、孕次、自然流產(chǎn)次數(shù)、孕前BMI、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、SNP 43位點(diǎn)、SNP 63位點(diǎn)和19位點(diǎn)一共15個(gè)因素進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，篩選出年齡、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、SNP 43位點(diǎn)5個(gè)有意義的變量，結(jié)果顯示糖尿病家族史危險(xiǎn)性最大，OR為7.232，其次為SNP 43位點(diǎn)，其余也顯示增加了患GIGT和GDM的危險(xiǎn)性（表5）。

表5 單因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4.2 多因素Logistic回歸分析 以NGT組、GIGT組和GDM組為因變量，年齡、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史和SNP 43位點(diǎn)為自變量，建立多因素Logistic回歸模型。分析結(jié)果表明，在5個(gè)變量中，影響妊娠期糖代謝異常發(fā)病的危險(xiǎn)因素從大到小依次為：SNP 43、糖尿病家族史、△BMI、孕期BMI、年齡。SNP 43的OR值最大，為8.105；其次為糖尿病家族史，為5.821，強(qiáng)烈提示SNP 43和糖尿病家族史增加了GIGT和GDM的危險(xiǎn)度；其他包括年齡、孕期BMI、△BMI均與GIGT、GDM的發(fā)生具有相關(guān)性（表6）。

表6 多因素Logistic回 歸模型結(jié)果

續(xù)表6 多因素Logistic回歸模型結(jié)果

3 討 論

CAPN－10是calpain家族的一員，為細(xì)胞內(nèi)鈣依賴(lài)的半胱氨酸蛋白酶，存在于包括骨骼肌、肝臟和胰腺的許多組織中［3］，可參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化等過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，脂肪細(xì)胞分化以及胰島素誘導(dǎo)的胰島素受體1下調(diào)［4］。CAPN－10基因位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂（2q37.3），該區(qū)域與T2DM連鎖不平衡，該基因存在多種SNP，其mRNA在胰、肌肉和肝臟中表達(dá)，它可能與胰島素分泌、胰島素作用和肝臟中葡萄糖的產(chǎn)生有關(guān)［5］，若基因發(fā)生變異時(shí)會(huì)出現(xiàn)胰島素的分泌和功能異常，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。

CAPN－10基因最初是由Horikawa發(fā)現(xiàn)的，他指出該基因的3個(gè)SNP（43、19、63）與墨西哥美籍人T2DM 關(guān)聯(lián)。其中SNP 43的G／G純合子顯著增加了罹患T2DM的危險(xiǎn)度。Leipold等［6］對(duì)GDM患者及正常對(duì)照妊娠婦女的CAPN－10基因多態(tài)性（SNP 19、43、63）進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因SNP 63位點(diǎn)C等位基因與GDM遺傳易感性相關(guān)，而與19、43位點(diǎn)無(wú)相關(guān)性。隨后Shaat等［7］對(duì)斯堪的納維亞婦女CAPN－10基因多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示這一地區(qū)的GDM婦女和正常妊娠者其SNP 43和SNP 44沒(méi)有顯著差別。田靜等［8］、羅毅平等［9］、周龍等［10］在對(duì) CAPN－10基因多態(tài)性（SNP 19、43、63）的研究中發(fā)現(xiàn)，SNP 43位點(diǎn)多態(tài)性與GDM遺傳易感性有關(guān)，而與SNP 19、63則無(wú)關(guān)。同時(shí)，羅毅平等［11］通過(guò)對(duì)GDM患者脂肪及胎盤(pán)組織中CAPN－10mRNA的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織該基因表達(dá)的減少可能是GDM患者胰島素抵抗的重要原因，而胎盤(pán)中該基因的表達(dá)則與GDM及其胰島素抵抗的關(guān)系不明顯。本研究結(jié)果顯示在CAPN－10基因19、63位點(diǎn)上，GDM組、GIGT組與NGT組的基因型頻率、等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在43位點(diǎn)上，GDM組GG基因型頻率和 G等位基因頻率（92%、94.5%）明顯高于對(duì)照組（75%、87.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。這提示CAPN－10基因SNP 43位點(diǎn)多態(tài)性與GDM遺傳易感性有關(guān)，而與SNP 19、63位點(diǎn)可能與GDM的發(fā)生無(wú)關(guān)。這一結(jié)果與Leipold等［6］、Shaat等［7］的研究存在差異，但與田靜等［8］、羅毅平等［9］結(jié)論一致。這些研究結(jié)果之間的差異性表明，GDM的遺傳易感性存在著種族、地域的差異，同時(shí)GDM患者的多基因、多因素可能對(duì)CAPN－10基因的影響較大，可能GDM是多種遺傳和環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果。此外，樣本的數(shù)量也可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。

對(duì)于與妊娠期糖代謝異常發(fā)生有關(guān)的因素，國(guó)內(nèi)外已有大量研究報(bào)道。糖尿病家族史、高齡、肥胖是公認(rèn)的GDM的高危險(xiǎn)因素［12］，但仍有一些因素還在探討和研究中。遺傳因素在GDM的發(fā)生中起著相當(dāng)重要的作用。余平芝［12］進(jìn)行前瞻性研究中顯示，如果父母同時(shí)患糖尿病則孕婦妊娠期糖代謝異常發(fā)生的危險(xiǎn)性較無(wú)家族史者增加9倍，而且家族中糖尿病患者越多以及與孕婦親緣關(guān)系越近，孕婦GDM發(fā)生的危險(xiǎn)性越大。本次調(diào)查單因素及多因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果中，糖尿病家族史的OR值分別為7.232和5.821，與GIGT、GDM發(fā)病呈正相關(guān)，表明糖尿病家族史是妊娠期糖代謝異常發(fā)生的高危因素。

由于肥胖者體內(nèi)脂肪對(duì)胰島素不敏感，產(chǎn)生胰島素抵抗及葡萄糖不耐受，使胰島素分泌過(guò)多，引起胰島素下調(diào)，增加糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)性。而肥胖妊娠婦女在妊娠后期的胰島素抵抗及敏感性下降則更為顯著［13－14］。母體肥胖已經(jīng)是GDM較明確和公認(rèn)的高危因素。有研究［15－16］顯示，超重、肥胖和嚴(yán)重肥胖者比正常體質(zhì)妊娠婦女更容易發(fā)生GDM。本研究顯示，GDM組和GIGT組的孕期BMI、△BMI明顯高于對(duì)照組，本文還應(yīng)用單因素及多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示孕期BMI、△BMI的危險(xiǎn)性也大大提高（P＜0.01），也證明了肥胖可增加糖代謝異常發(fā)生的危險(xiǎn)性，提示孕婦可通過(guò)飲食和運(yùn)動(dòng)等來(lái)控制體質(zhì)量，以減少肥胖的發(fā)生，進(jìn)而減少GDM的發(fā)生，因此，控制婦女肥胖也是預(yù)防GDM發(fā)生的重要因素。

由于妊娠期的糖代謝特點(diǎn)，妊娠本身具有促進(jìn)糖尿病形成的作用。隨著年齡增長(zhǎng)，糖尿病的發(fā)病率也增加。有研究顯示35歲以上的孕婦糖篩查異常率是25歲以下者的2～4倍，GDM發(fā)生率是5.5倍［17］。本研究通過(guò)單因素和多因素Logistic回歸分析OR值分別為1.275、1.027，P＜0.05，均顯示出孕婦年齡可增加妊娠期糖代謝的危險(xiǎn)性。

人們的文化程度可決定其社會(huì)地位、自我保健意識(shí)等，可直接影響著人們的生活習(xí)慣、行為方式及精神狀況等方面。有調(diào)查研究［18］顯示文化程度與糖尿病的發(fā)病相關(guān)，文化程度高是糖尿病的保護(hù)因素，表明文化程度越高，發(fā)生糖尿病危險(xiǎn)性越低。這可能與文化程度較高的人群，了解和掌握更多的預(yù)防保健知識(shí)，更注重身體健康和自我保健有關(guān)。目前，對(duì)于受教育程度與妊娠期糖代謝異常的關(guān)系報(bào)道不多，但在本研究中，多因素Logistic回歸分析結(jié)果未顯示受教育程度與GDM發(fā)病的相關(guān)性（P＝0.053，OR＝0.536），這可能與妊娠這一特殊的生理時(shí)期有關(guān)，也可能是與研究對(duì)象的樣本量有關(guān)，需要在今后的研究中進(jìn)一步研究討論。

綜上所述，妊娠期糖代謝異常的發(fā)生是多源性的，是遺傳、社會(huì)及飲食等多因素多種環(huán)境共同作用的結(jié)果，同時(shí)，糖尿病的發(fā)生也與種族、民族及地域等相關(guān)。孕婦在孕24～28周進(jìn)行糖尿病篩查是必要的，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)妊娠期健康教育的大力宣傳，培養(yǎng)健康的生活方式、飲食習(xí)慣，適量運(yùn)動(dòng)和普及人群糖尿病預(yù)防及保健知識(shí)等綜合措施。同時(shí)，對(duì)具有高危因素的孕婦應(yīng)重點(diǎn)監(jiān)護(hù)，指導(dǎo)其合理飲食，控制其體質(zhì)量增長(zhǎng)，對(duì)血糖密切監(jiān)測(cè)，并早期進(jìn)行篩查，以減少妊娠期糖代謝異常的發(fā)生，減少對(duì)母嬰的危害。

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