澤瀉指紋圖譜研究

李行諾，馬 旭，楚 楚，金輝輝，楊 陽，顏繼忠

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

澤瀉指紋圖譜研究

李行諾，馬 旭，楚 楚，金輝輝，楊 陽，顏繼忠

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

建立澤瀉飲片的高效液相指紋圖譜，研究不同購買地澤瀉飲片的質(zhì)量，為科學(xué)評價及有效控制其質(zhì)量提供參考.使用Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，以乙腈－水為流動相采用梯度洗脫法進(jìn)行色譜分離.11批樣品得到的色譜指紋圖譜有25個共有峰，其中3，5，6，8，10，12號峰分別被鑒定為澤瀉醇F，24-乙酰澤瀉醇F，23-乙酰澤瀉醇E，24-乙酰澤瀉醇A，25-去羥基澤瀉醇A，11-去氧澤瀉醇A.首次使用澤瀉中多個三萜類成分作為對照品對指紋圖譜色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，結(jié)果重現(xiàn)性好，為控制澤瀉飲片的質(zhì)量提供可靠的分析方法.

澤瀉；指紋圖譜；高效液相

澤瀉（Alismaorientalis）為澤瀉科澤瀉屬植物的干燥塊莖.味甘，性寒，歸腎、膀胱經(jīng).具有利小便、清濕熱等功效.用于小便不利，水腫脹滿，泄瀉尿少，痰飲眩暈，熱淋澀痛等癥［1］.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：澤瀉具有利尿、降血脂和降血壓等功效［2］，其主要藥效成分為原萜烷型四環(huán)三萜類化合物，種類較多，因此質(zhì)量控制也更為困難.歷年來也有不少學(xué)者做過澤瀉指紋圖譜的研究［3－6］，為澤瀉的進(jìn)一步研究提供了非常有價值的實(shí)驗(yàn)依據(jù).本實(shí)驗(yàn)以澤瀉飲片為實(shí)驗(yàn)材料，通過高效液相色譜法研究并建立其指紋圖譜，并通過已經(jīng)建立的指紋圖譜方法對11批不同購買地的澤瀉飲片進(jìn)行研究，利用與對照品對比的方法，對指紋圖譜中的6個主要色譜峰進(jìn)行了指認(rèn).該方法首次使用澤瀉中的多個原萜烷型四環(huán)三萜類［7］成分作為對照品對澤瀉指紋圖譜色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，可用于澤瀉藥材、飲片及提取物中三萜類成分的定性質(zhì)量評價，為澤瀉及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供補(bǔ)充.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料、儀器與試藥

1.1.1 材 料

11批飲片購自各地藥店，來源見表1，均由楚楚博士鑒定為正品，留樣保存于浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院.澤瀉醇F，24-乙酰澤瀉醇F，23-乙酰澤瀉醇E，24-乙酰澤瀉醇A，25-去羥基澤瀉醇A，11-去氧澤瀉醇A為對照品，由本實(shí)驗(yàn)室分離制備所得.

表1 11批澤瀉藥材信息表Table 1 Information of 11 samples of Alismaorientalis

1.1.2 儀器和試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；RE2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JA2003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；有機(jī)針筒過濾器，直徑13 mm，孔徑0.45μm（上海興亞凈化材料廠）；Millipore Q-7純水儀（美國 Millipore公司）；KQ3200型數(shù)控超聲儀超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）.

對照品澤瀉醇F，24-乙酰澤瀉醇F，23-乙酰澤瀉醇E，24-乙酰澤瀉醇 A，25-去羥基澤瀉醇 A，11-去氧澤瀉醇A均為自制（經(jīng)核磁和質(zhì)譜鑒定，采用峰面積歸一化法計(jì)算，純度均大于98%）；甲醇為分析純（上海陸都化學(xué)試劑廠），乙腈為色譜純（美國Tedia公司），水為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜 柱：Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1 mL／min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：35℃；記錄時間：90 min；流動相：乙腈—水，按表2的條件進(jìn)行梯度洗脫.數(shù)據(jù)處理軟件使用國家食品藥品監(jiān)督管理局采用的“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件（2004A）”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.1.2.2 對照品溶液的制備

取澤瀉醇F，24-乙酰澤瀉醇F，23-乙酰澤瀉醇E，24-乙酰澤瀉醇 A，25-去羥基澤瀉醇 A，11-去氧澤瀉醇A對照品，精密稱定.用色譜甲醇配制成質(zhì)量濃度均為1.0 g／L的對照品溶液，冷藏備用.

表2 高效液相色譜流動相條件Table 2 Mobile phase of the HPLC

1.2.3 供試品溶液的制備

澤瀉飲片粉碎，過80目篩，取粉末2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL超聲提取45 min，過濾，旋蒸得浸膏.加少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容至5 mL.用0.45μm有機(jī)微孔膜過濾，取過濾液，即得.

1.2.4 方法學(xué)考察

取同一份供試品溶液，按1.2.3方法處理，按1.2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)樣測定進(jìn)行精密度考察.取同一批樣品6份，按1.2.3方法制備供試品溶液，按1.2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)樣測定進(jìn)行重復(fù)性考察.取同一批供試品溶液，按1.2.3方法處理，按1.2.1色譜條件分別在0，2，6，12，24，48 h進(jìn)樣測定進(jìn)行穩(wěn)定性考察.

1.2.5 澤瀉指紋圖譜的建立

按1.2.3方法制備11批澤瀉提取物供試品溶液，在1.2.1色譜條件下依次進(jìn)樣測定，并記錄90 min內(nèi)的色譜圖.按1.2.2方法制備澤瀉對照品溶液，按1.2.1色譜條件進(jìn)樣測定.澤瀉提取物供試品溶液色譜圖，如圖1所示.澤瀉對照品溶液色譜圖，如圖2所示.11批澤瀉提取物樣品色譜峰疊加圖，如圖3所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 澤瀉供試品的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

供試品溶液中各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在0.15%和2.9%以內(nèi)，各指紋圖譜相似度都在0.95以上，說明儀器精密度良好，澤瀉供試品溶液的重復(fù)性良好且在48 h內(nèi)穩(wěn)定性.符合色譜指紋圖譜研究技術(shù)的要求.

2.2 參照峰的選擇

根據(jù)圖1可以看出色譜圖各峰的峰強(qiáng)度有很大差異，其中1—3，5—12，14，15，19，22，23號峰峰形及分離度較好，確定這16個峰為共有峰.通過與對照品對照，指認(rèn)了其中6個色譜峰.即3號峰為澤瀉醇F，5號峰為24-乙酰澤瀉醇F，6號峰為23-乙酰澤瀉醇E，8號峰為24－乙酰澤瀉醇A，10號峰為25－去羥基澤瀉醇A，12號峰為11-去氧澤瀉醇A.

2.3 指紋圖譜技術(shù)參數(shù)

將11批飲片的HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.以S5批飲片譜圖作為參照譜進(jìn)行指紋匹配，計(jì)算樣本圖譜與對照圖譜的相似度，對11批藥材共有峰的相對保留時間與相對峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表3所示.由表3可知：11批澤瀉藥材的保留時間RSD在0.28%以內(nèi)變化較小，峰面積RSD變化較大，表明各地澤瀉飲片化學(xué)成分的含量存在一定差異.

表3 11批澤瀉樣品色譜圖共有峰的保留時間和峰面積1）Table 3 HPLC fingerprint of retention time and peak area of 11 samples of Alisma orientalis

2.4 色譜條件的考察

實(shí)驗(yàn)中考察不同提取溶劑對指紋圖譜的影響，最終發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取45 min，回收溶劑并用甲醇定容出峰最多.以甲醇—水，乙腈—水作為流動相，通過調(diào)整溶劑比例進(jìn)行檢測，由色譜圖比較可知甲醇－水體系基線漂移很嚴(yán)重且各色譜峰相互重疊較多，沒有達(dá)到分離的效果；乙腈－水體系出峰比較多，基線較平，色譜峰分離度較好，因此選擇以不同比例的乙腈和水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫.對不同色譜柱的分離效果進(jìn)行了考察，考察了Agilent Zorbax Eclipse-C18，Zorbax Extend-C18，Zorbax SB-C18色譜柱對提取物的分離情況，綜合分離度、峰形、穩(wěn)定性及使用范圍等各種因素，選用Zorbax Extend-C18色譜柱較為合適.考察了不同波長對圖譜的影響，在210 nm處特征峰響應(yīng)較高，色譜峰信息量最大，而這也是澤瀉中三萜類化合物主要的吸收波長.

3 結(jié) 論

在摸索了大量色譜條件的前提下，建立了澤瀉的指紋圖譜.最終確定采用HPLC法進(jìn)行測定，色譜柱為 Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1 mL／min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為35℃，記錄時間為90 min，流動相為乙腈—水.首次使用多個原萜烷型四環(huán)三萜類化合物作為對照品對澤瀉指紋圖譜色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果經(jīng)方法學(xué)考察，重現(xiàn)性強(qiáng)，精密度與穩(wěn)定性好，可用于澤瀉藥材、飲片及提取物中三萜類成分的定性質(zhì)量評價，為澤瀉及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供補(bǔ)充.

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：158.

［2］徐暉.澤瀉藥理作用研究進(jìn)展［J］.湖南中醫(yī)雜志，2004，20（3）：77.

［3］劉紅昌，楊文鈺，陳興福.四川道地藥材澤瀉指紋圖譜的建立及其質(zhì)量研究［J］.中國中藥雜志，2007，432（18）：1844-1847.

［4］鞏麗萍，王少云，張克.澤瀉飲片的HPLC-ELSD指紋圖譜研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18（6）：461-464.

［5］許丹，楊松松.澤瀉指紋圖譜的初步研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2003，14（12）：727-728.

［6］LIU Xin，LI Song-lin，ZHOU Yan，et al.Characterization of protostane triterpenoids inAlismaorientalisby ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-offlight mass［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24：1514-1522.

［7］朱玉嵐，彭國平.澤瀉的萜類化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（4）：348-351.

Research of chromatographic fingerprint on Alisma orientalis

LI Xing-nuo，MA Xu，CHU Chu，JIN Hui-hui，YANG Yang，YAN Ji-zhong
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

To develop a HPLC method of the chromatographic fingerprint ofAlismaorientalisfor quality control.The HPLC chromatographic profiles were determined on the Zorbax Extend-C18Column（250 mm×4.6 mm，5μm）eluted with the mobile phases of water and acetonitrile in gradient mode.The HPLC chromatographic fingerprint with 25 common peaks was established from 11 lots ofA.orientalis.Six peaks were identified as alisol F，24-acetyl alisol F，23-acetyl alisol E，24-acetyl alisol A，25-dehydroxy alisol A and 11-deoxyalisol A.The HPLC fingerprint method is repeatable，feasible for the quality control ofA.orientalisand the preparations.

Alismaorientalis；chromatographic fingerprint；HPLC

R284.1

A

1006-4303（2013）02-0143-04

2012-03-16

浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y200908190）；浙江工業(yè)大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”項(xiàng)目（2010036）

李行諾（1981—），男，河南滎陽人，講師，博士，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究，E-mail：li＿xingnuo＠yahoo.com.cn.

（

陳石平）