KLK7蛋白及 E-鈣黏蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

佟麗波,王 晶,王春敏,朱貴明,姚海濤,盧北燕,佟秀鳳,張 燕

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

子宮內(nèi)膜癌是婦科最重要的惡性腫瘤之一,在西方發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率居女性生殖器官惡性腫瘤的第一位。近年來(lái)中國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也有明顯上升的趨勢(shì),通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)可以從根本上提高其預(yù)防診斷和治療水平[1]。上皮型鈣黏蛋白-E是細(xì)胞間黏附分子的重要成員,不光介導(dǎo)細(xì)胞之間的黏附,而且細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也可直接參與。對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]。KLK7基因近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在人體許多組織和器官中均有表達(dá),而且和多種腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展、浸潤(rùn)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)重組人激肽釋放酶7蛋白和 E-鈣黏蛋白在增生期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況,探討研究其表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源及分組

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔蠟塊(2007～

2012年 )均為在本院第一次手術(shù),術(shù)前未進(jìn)行放、化療治療,將實(shí)驗(yàn)分為3組。Ι組:子宮內(nèi)膜不典型增生30例,子宮切除術(shù)后病理診斷為子宮內(nèi)膜不典型增生中度-重度。年齡36～55歲,平均 47.5歲。Ⅱ組:子宮內(nèi)膜癌組 35例,子宮切除術(shù)后經(jīng)病理診斷為子宮內(nèi)膜腺癌,其中浸潤(rùn)淺肌層為16例,浸潤(rùn)深肌層為9例。年齡35～ 74歲,平均 57.3歲。Ⅲ 組:對(duì)照組16例,門(mén)診行診斷性刮宮術(shù),術(shù)后病理診斷為功血 ,均為增生期。術(shù)前均未用過(guò)性激素類(lèi)藥物治療。年齡25～ 48歲,平均41.2歲。以上實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均由病理科醫(yī)師證實(shí)。

1.2 主要試劑

免抗人 KLK7多克隆抗體(北京博奧森公司),免抗 E-cad多克隆抗體 (福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司),DAB顯色試劑盒(福州邁新公司),SP免疫組化試劑盒 (福州邁新公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)將固定于福爾馬林中的標(biāo)本進(jìn)行烤片,68℃烘烤20min。(2)常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水。(3)阻斷 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。(4)將檸檬酸鈉緩沖液置于容器后放入組織,加熱冷卻2次。(5)用 PBS沖洗血清封閉、孵育。(6)滴加按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,KLK7抗體工作液稀釋比例為1:100,E-cad抗體工作液稀釋比例為 1:200。4℃過(guò)夜。(7)PBS沖洗三次。(8)滴入二抗,孵育。(9)加入 DAB顯色劑。(10)封片。

1.4 結(jié)果判定

KLK7蛋白為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜表達(dá),呈棕黃色著色為陽(yáng)性表達(dá)。E-cad蛋白為細(xì)胞膜表達(dá),呈棕黃色著色為陽(yáng)性表達(dá)。按照細(xì)胞陽(yáng)性著色程度(抗原含量 )可分為:細(xì)胞無(wú)顯著著色者為()記0分,淺黃色弱陽(yáng)性者為()記1分,棕黃色中等陽(yáng)性者為)記 2分,棕褐色強(qiáng)陽(yáng)性者為)記3分;按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量可分為:弱陽(yáng)性(指陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)25%以下)者(),中等陽(yáng)性(指陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)25%～ 49%)者(),強(qiáng)陽(yáng)性 (指陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)50%以上 )()。應(yīng)用積分綜合計(jì)量。計(jì)算公式:()%×0+()%× 1+ ()%×2+()%× 3:;總數(shù)值 ＜1.0者為(+),1.0～1.5者為 (),＞ 1.5者為 ()。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得的全部數(shù)據(jù)采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行i2檢驗(yàn),以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLK7蛋白在正常組、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá):正常組為12.5%,在子宮內(nèi)膜不典型性增生組為 85%,在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)為92%。與正常組比較,子宮內(nèi)膜不典型性增生組升高 ,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。正常組與子宮內(nèi)膜癌比較,KLK7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高(P ＜ 0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 KLK7蛋白子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)

2.2 E-cad蛋白在正常組、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá):正常組為81.25%,在子宮內(nèi)膜不典型性增生組為 65%,在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)為44%。與正常組比較,子宮內(nèi)膜不典型性增生組升高 ,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。正常組與子宮內(nèi)膜癌比較,E-cad蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高(P ＜ 0.05)。見(jiàn)表 2。

表2 E-cad蛋白子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,多發(fā)于圍絕經(jīng)期女性和絕經(jīng)后女性,是導(dǎo)致死亡的僅次于卵巢癌和宮頸癌的第三名婦科惡性腫瘤[3]。目前發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與生活方式關(guān)系密切,不同地域發(fā)病率不同,在北美和歐洲發(fā)病率高居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首。在我國(guó)子宮內(nèi)膜癌隨著社會(huì)發(fā)展和生活水平的提高,發(fā)病率也有上升的趨勢(shì)。現(xiàn)排在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第二位,僅次于宮頸癌。

KLK7蛋白是一種絲氨酸蛋白,是組織激肽釋放酶(KLK)基因家族的新成員,最早被在人足底皮膚的角化層中分離提純[4]。KLK7蛋白主要是在角質(zhì)層上皮細(xì)胞表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)它廣泛分布在人體組織和器官中,參與皮膚脫屑的過(guò)程[5]。對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起著重要的作用。腫瘤細(xì)胞表層的 KLK7蛋白可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的脫落及轉(zhuǎn)移有影響。相關(guān)研究表明[6],KLK7基因在胰腺癌組織中表達(dá)顯著加強(qiáng),該基因的表達(dá)與胰腺癌的預(yù)后有關(guān)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),KLK7基因在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性率表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜不典型性增生和正常子宮內(nèi)膜。KLK7基因在子宮內(nèi)膜上升趨勢(shì)的高表達(dá)表示該基因可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要潛在因素。加上 KLK7在皮膚中就具有促進(jìn)角質(zhì)層細(xì)胞脫落的作用,綜上,我們推測(cè)出 KLK7基因在子宮內(nèi)膜癌中的作用很有可能與絲氨酸蛋白酶參與細(xì)胞間質(zhì)的溶解和腫瘤細(xì)胞早期脫落有關(guān),而且與促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)一步浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。由此可見(jiàn),對(duì) KLK7蛋白廣泛深入的研究,可了解腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和擴(kuò)散的具體機(jī)制,為腫瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。

E-cadherin是一種分子量為120KD的鈣依賴(lài)性黏附蛋白分子,主要在上皮細(xì)胞中分布,在細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生和維持上皮的完整性以及同型細(xì)胞間的黏附、腫瘤細(xì)胞間保持密切接觸等方面有著重要影響。E-cad蛋白正常情況下均在細(xì)胞邊緣區(qū)成陽(yáng)性表達(dá),但在腫瘤組織中一般為低表達(dá)或是陰性表達(dá)。其低表達(dá)或是缺失可導(dǎo)致同型細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)和功能異常,使介導(dǎo)細(xì)胞的黏附功能降低或喪失,而無(wú)限制增生導(dǎo)致使腫瘤浸潤(rùn)和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[7,8]。本實(shí)驗(yàn)表明,E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型性增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)明顯下降,說(shuō)明 E-cad蛋白的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有著密切的相關(guān)性。與相關(guān)研究結(jié)果相符合。進(jìn)而可推測(cè) E-cad蛋白低表達(dá)時(shí)可使細(xì)胞間黏附功能降低且腫瘤細(xì)胞間喪失接觸性抑制,腫瘤細(xì)胞更容易分離、增生、脫落,擴(kuò)散。

本研究顯示,KLK7蛋白與E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌的陽(yáng)性表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)性,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推斷,KLK7蛋白與 E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)中有著密切的關(guān)系。E-cad蛋白在正常子宮內(nèi)膜中的高表達(dá)說(shuō)明其維持著子宮內(nèi)膜上皮的完整性,當(dāng) E-cad的陽(yáng)性率降低時(shí)可能引起腫瘤細(xì)胞有離散的趨勢(shì),容易與原發(fā)灶脫落,出現(xiàn)浸潤(rùn)臨近的組織,發(fā)生轉(zhuǎn)移。與相關(guān)研究結(jié)果相符合。進(jìn)而可推測(cè) E-cad蛋白低表達(dá)時(shí)可使細(xì)胞間黏附功能降低且腫瘤細(xì)胞間喪失接觸性抑制,腫瘤細(xì)胞更容易分離、增生增值、脫落,擴(kuò)散。因此,E-cad的缺失表達(dá)提示著 E-cad蛋白參與者腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展,當(dāng) E-cad蛋白缺失時(shí),腫瘤細(xì)胞將具有更高的侵襲力和不良的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn),KLK7蛋白可以通過(guò)裂解 E-鈣黏蛋白而增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的能力,阻斷其連接,減少聚合能力。說(shuō)明 KLK7蛋白和 E-cad蛋白在癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。

總之,腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是非常復(fù)雜的生物學(xué)行為,許多轉(zhuǎn)移基因和轉(zhuǎn)移抑制基因都和此過(guò)程密切相關(guān)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究分析,在子宮內(nèi)膜癌中,KLK7蛋白和 E-cad蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性,兩者協(xié)同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。綜上所述,KLK7蛋白和 E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用,對(duì)監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者的病情及預(yù)后有著重要的意義。但兩者確切的生理功能、蛋白作用機(jī)制和基因調(diào)控機(jī)制,相互作用機(jī)制尚未完全清楚,尚待進(jìn)一步研究。

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