Eph A2在膀胱癌中的表達及意義

張東東,扈清云,王培軍,歐葉濤,韓 曦,陳乃峰,尹興忠,鐘堂武,梁衍鋒

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

膀胱癌是一種最常見的原發(fā)于膀胱上皮細胞的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,其惡性程度和復(fù)發(fā)率較高。通過研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致膀胱癌的原因有很多,其中基因和生活環(huán)境尤為主要。通過以往的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)膀胱細胞內(nèi)一個或多個抗癌基因的失活或癌基因的激活膀胱癌的發(fā)生主要因素。因此,我們通過分子遺傳學(xué)研究膀胱癌不僅有助于膀胱癌的發(fā)病機制及膀胱腫瘤基因的研究,而且對膀胱腫瘤的診斷及預(yù)后均有著十分重要的指導(dǎo)意義。本實驗主要研究的是 EphA2(erythropoietin producing hepatoma cell line A2),EphA2是 EphA亞家族受體8個成員中的第2個[1,2]。在人的多種細胞系或組織中都有 EphA2表達。人類 EphA2基因位于染色體1p36.1上,其含有 17個外顯子。EphA2能夠調(diào)節(jié)細胞增生主要體現(xiàn)在:EphA2的過度表達時能使正常細胞發(fā)生變異[3],正常情況下當(dāng) EphA2與配體結(jié)合后,削弱誘導(dǎo)細胞生長的生長因子活性,從而抑制了細胞的生長。因此當(dāng) EphA2正常表達時可抑制細胞發(fā)生增生,異常表達時則可以促進細胞轉(zhuǎn)化。本次實驗采用免疫組織化學(xué)法和 RT-PCR法檢測正常膀胱組織與膀胱癌組織中的 EphA2異常表達率,通過本次試驗分析正常膀胱組織和膀胱癌組織中 EphA2表達,觀察蛋白水平和基因水平表達的相互關(guān)系,能為膀胱癌在其發(fā)病、診斷治療以及臨床預(yù)后提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗材料來自于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,其中正常膀胱組織新鮮的10例,膀胱癌組織新鮮的31例,此外還有膀胱癌石蠟組織標(biāo)本40例。

1.2 實驗試劑

瓊脂糖,DEPC液,枸櫞酸緩沖液,DAB顯色試劑盒,兔抗人 EphA2多克隆抗體,2000bpMarker,PBS緩沖液,Taq DN A聚合酶,引物,Trizol,GAPDH,SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (寶生物工程(大連)有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 1RT-PCR法:實驗前將所有使用器具用濃硫酸和DEPC水浸泡,高溫高壓消毒,烘干保存。

1.3.2 提取正常膀胱組織和膀胱癌組織的 RN A并檢測:首先使用勻漿器將癌組織和正常膀胱組織進行勻漿處理,其次將勻漿后的組織加入提取液離心,最后加 RNA抑制酶離心后保存。使用凝膠電泳檢測提取的 RN A是否完整。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄:將提取到的 mRN A進行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDN A并對其擴增。

1.3.4 RT-PCR:制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.5 將 RT-PCR實驗所得凝膠利用天能 GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)對進行分析,得出數(shù)據(jù)。

1.4 免疫組化(SABC)法

本實驗標(biāo)本包括新鮮組織標(biāo)本和膀胱癌石蠟組織標(biāo)本,先將新鮮組織標(biāo)本進行固定后脫水形成石蠟標(biāo)本。將所有石蠟組織切片常規(guī)免疫組化處理加入兔抗人 EphA2多克隆抗體封片計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

利用 SPSS16.0軟件對所得出的數(shù)據(jù)進行 t檢驗和卡方檢驗,P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法 EphA2的檢測

通過 RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn) EphA2在膀胱癌組織中的表達明顯高于正常膀胱組織的表達。

表1 RT-PCR法檢測 Eph A2在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達

2.2 免疫組化 EphA2的檢測

EphA2免疫組化陽性物質(zhì)呈棕黃色,EphA2免疫染色定位在膀胱細胞膜和細胞漿,在正常膀胱黏膜上皮中,EphA2呈陰性或弱陽性表達。而當(dāng)膀胱發(fā)生癌癥病變時會隨著癌癥的分化高低的不同而改變。分化越高表達越低,分化越低表達越高。通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中 EphA2的異常率表達為77.46%(55/71),正常膀胱黏膜組織異常率的表達為20%,EphA2在膀胱癌組織中的異常表達率明顯高于正常組織 (P ＜ 0.01)。

表2 免疫組化(SABC)法分析 EphA2在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達

3 討論

在研究發(fā)現(xiàn) EphA2對細胞的增生具有一定的調(diào)節(jié)作用[4,5]。通過在蛋白水平研究表明 EphA2在膀胱移行細胞癌中發(fā)現(xiàn):當(dāng) EphA2在正常表達情況下可抑制細胞增生,而異常表達時可以促進細胞的轉(zhuǎn)化。本實驗采用 RT-PCR法以及免疫組織化學(xué)技術(shù),檢測了71例膀胱移行細胞癌和10例正常膀胱組織的 EphA2的表達情況發(fā)現(xiàn):在基因水平上膀胱移行細胞癌的 EphA2表達高于正常膀胱組織中的 EphA2表達,利用免疫組織化學(xué)方法蛋白檢測膀胱移行細胞癌的EphA2表達高于正常膀胱組織中的 EphA2表達,兩種檢測方法得出的結(jié)論一致。本研究得到:在膀胱移行細胞癌中EphA2的基因與蛋白有著重要的聯(lián)系,EphA2的基因決定了EphA2蛋白的表達。這一結(jié)果提示 EphA2在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著十分重要的作用,從而為膀胱癌的發(fā)生、診斷和治療等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

[1]Gale NW,Holland SJ,Va Lenzuela DM,et al.Eph receptors and ligands comprise two major specificity subclasses and are reciprocall compartmentalized during embryogenesis[J].Neuron,1996,17:9-19

[2]Dodelet V C,Pasquale EB.Eph receptors and ePhrin ligands:embryogencsis to tumorigencsis[J].Oncogene,2000,19:5614-5619

[3]Yarden Y,Ullrich A.Growht factor receptor tyrosine kinases[J].Annu Rev Biochem,1988,57:443-478

[4]閻紅娥,袁魯娜,鮑文華,等.EphA2和 KAI-1在非小細胞肺癌中的表達及意義 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2010,33(6):26-27

[5]段有軍,李解方,曹友漢,等.EphA2和 E-cadherin蛋白在腎透明細胞癌中表達及其意義 [J].中國實驗診斷學(xué),2011,7:1092-1094