肝癌HSP70-肽復(fù)合物抗腫瘤研究

黃學(xué)珍，劉學(xué)政

（1.吉水縣雙村鎮(zhèn)衛(wèi)生院普外科，江西 吉水331602；2.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 吉安 343000）

肝癌是臨床上常見(jiàn)的惡性度很高的腫瘤，即使進(jìn)行了根治性手術(shù)、規(guī)范性放療和化療，患者的晚期總會(huì)發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。其根本原因是患者的免疫功能受到破壞，腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[1]。因此通過(guò)藥物或生物制劑的作用，提高腫瘤患者的免疫功能，改變腫瘤患者的免疫低下及免疫缺陷，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫力和殺傷力，對(duì)抗腫瘤的研究具有重要的指導(dǎo)意義；其次，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在機(jī)體抗腫瘤作用中起重要作用，因此誘導(dǎo)激活T細(xì)胞的主動(dòng)抗腫瘤作用是提高機(jī)體免疫能力的重要環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)改良的凝膠梯度洗脫法從手術(shù)切取肝癌組織中分離出HSP70-肽復(fù)合物并激活T淋巴細(xì)胞，觀察激活T淋巴細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)本肝癌組織系井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院提供，均經(jīng)病理診斷為細(xì)胞性肝癌。蛋白分子質(zhì)量Marker（廣州華美生物工程公司），DEAE-52纖維素（whatman 分裝），SGC-6801 肝癌細(xì)胞珠（sigma公司），硝酸纖維素薄膜（上海生物制品所），3H-TdR（美國(guó)強(qiáng)生公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1）肝癌HSP70-肽復(fù)合物的提取和純化：取肝癌組織 125 g，勻漿，經(jīng) 43℃加熱 1 h，離心（1 000 r·min-1,10 min）取上清液，5 h后用4倍體積裂解液[0.05 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.2），含 0.05%trypsin、0.1 mmol·L-1PMSF、0.1%NaHPO4·12H2O]裂解細(xì)胞，胞膜破裂后高速離心（5 000 r·min-1,15 min）取上清液，用SephadexG-100粉50 g和層析緩沖液100 mL充分?jǐn)噭?，用玻璃層析柱使其沉降倒除上層混懸液后靜止3 d。經(jīng)DEAE-52 cellulose柱梯度洗脫，測(cè)吸光度A值（波長(zhǎng)280 nm），收集各峰蛋白，通過(guò)對(duì)分子質(zhì)量的鑒定，取相對(duì)分子質(zhì)量70 000組份。

2）T淋巴細(xì)胞的提取：用尼龍毛和磁珠交聯(lián)法分離T淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC，將要分離的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）倒入注射器內(nèi)，蓋上注射器，37℃溫育36 min至1 h。將特異性抗T淋巴細(xì)胞單克隆抗體與磁性小珠交聯(lián)形成免疫磁珠，用免疫磁珠從PBMC中結(jié)合T淋巴細(xì)胞，打開(kāi)下口，緩慢放流（1滴·min-1），收集于離心管中。

3）肝癌HSP70-肽復(fù)合物激活T淋巴細(xì)胞：于48孔板中加入T淋巴細(xì)胞（1×106反應(yīng)細(xì)胞）和肝癌HSP70-肽復(fù)合物，置37℃。5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，予離心（1 000 r·min-1,10 min）后收集其上清液。

4）肝癌HSP70-肽復(fù)合物激活T淋巴細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的體外殺傷作用：建立實(shí)驗(yàn)組（效應(yīng)細(xì)胞為肝癌HSP70-肽復(fù)合物激活T淋巴細(xì)胞）和對(duì)照組（為未經(jīng)激活的淋巴細(xì)胞），每組50份樣本，并分別設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞平行對(duì)照孔，培養(yǎng)基調(diào)靶細(xì)胞濃度為1×104mL-1，效應(yīng)細(xì)胞濃度為1×104mL-1，效靶之 50∶1,陰性對(duì)照孔只加 100 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照孔中加100 μL 1 mol·L-1鹽酸，每孔效靶細(xì)胞各 100 μL，總體積 200 μL，細(xì)胞混勻，37 ℃、5%CO2、飽和適度培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入新鮮配制的 5 mg·mL-1的 MTT 20 μL，離心（1 000 r·min-1）10 min，從每孔中吸出 150 μL 上清液，每孔加入分析純MDSO 150 μL，震蕩溶解5 min，于酶標(biāo)儀上570 nm處讀取OD值，按下列公式計(jì)算殺傷率：殺傷活性=上清液cpm×2/（細(xì)胞cpm+上清液cpm×2）×100%，cpm為每分鐘放射性活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用x±s表示，各組間比較用兩個(gè)樣本的t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用單個(gè)樣本的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肝癌細(xì)胞經(jīng)DEAE-52纖維素柱梯度洗脫分離后共有4個(gè)蛋白峰，各峰蛋白經(jīng)電泳和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定第一峰蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量70 000處有一深染的蛋白帶，為此本研究得到了相對(duì)分子質(zhì)量約為70 000的肝癌HSP70-肽復(fù)合物。

肝癌HSP70肽復(fù)合物激活T淋巴細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）對(duì)肝癌細(xì)胞具有明顯的殺傷力，未經(jīng)肝癌HSP70-肽復(fù)合物激活的T淋巴細(xì)胞（對(duì)照組）對(duì)肝癌細(xì)胞幾無(wú)殺傷力，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且殺傷活性隨著效靶比增加而增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 2組肝癌細(xì)胞殺傷率比較 x±s,%

3 討論

熱休克蛋白（HSP）是高度保守的蛋白質(zhì)。HSP根據(jù)其分子質(zhì)量的大小分為HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子HSP 4個(gè)家族，各家族在正常的生理反應(yīng)中低水平表達(dá)[2-3],然而，當(dāng)機(jī)體受到紫外線(xiàn)照射、病毒感染、感染性休克、失血性休克、重金屬中毒、細(xì)菌感染、放射性照射、寄生蟲(chóng)感染、細(xì)胞腫瘤惡化的病理和生理刺激情況下HSP的合成迅速增加。HSP70是HSP中最保守，含量最豐富的一類(lèi)。HSP70在應(yīng)激刺激及病理狀態(tài)下生成最為顯著，它作為分子伴侶與新結(jié)合的多肽鏈結(jié)合，并參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊，裝配降解和修復(fù)過(guò)程，同時(shí)，HSP70具有與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和多肽相互作用的功能，以維護(hù)蛋白的自穩(wěn)系統(tǒng)，在細(xì)胞的信息傳遞、分化及獲得性免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用，而且它又可作為一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)對(duì)機(jī)體損傷產(chǎn)生自身保護(hù)作用[4]。

有學(xué)者對(duì)MCA誘導(dǎo)的小鼠肉瘤HSP70的免疫作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)被免疫鼠產(chǎn)生了抵抗相應(yīng)HSP活細(xì)胞移植的能力，但正常組織來(lái)源的HSP不產(chǎn)生這種抗腫瘤移植的能力，而用滅活的自體腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生對(duì)同一腫瘤的移植排斥，說(shuō)明HSP誘導(dǎo)的免疫也具有很強(qiáng)的特異性，僅對(duì)該腫瘤有作用，從而推測(cè)腫瘤細(xì)胞中存在腫瘤特異抗原，并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)小鼠腫瘤移植存在不同個(gè)體特異性腫瘤抗原及HSP70具有腫瘤免疫原性[5-6]。

HSP70-肽復(fù)合物在腫瘤免疫中的作用及機(jī)制及激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的抗腫瘤免疫有重要意義，DC是最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，HSP70有效地將腫瘤抗原肽傳遞給DC，從而達(dá)到高效應(yīng)腫瘤抗原肽的作用，HSP70作為其免疫佐劑具有以下4個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）用凝膠梯度洗脫法從腫瘤組織中制備的HSP70-肽復(fù)合物能結(jié)合多種腫瘤抗原，用它進(jìn)行機(jī)體腫瘤免疫，不需要確定并分離腫瘤特異性抗原免疫符合物。激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤特異的激活T淋巴細(xì)胞效應(yīng)，而且這種作用在同種間不受MHCI類(lèi)分子限制，為腫瘤疫苗治療提供了新的理論思路。2）腫瘤中提取的HSP70-肽復(fù)合物可活化多個(gè)T淋巴細(xì)胞，對(duì)所有腫瘤細(xì)胞均有殺傷的作用，避免了免疫逃逸和腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。3）HSP70-肽復(fù)合物具有佐劑的功能，因此腫瘤的制備不需要佐劑。4）免疫HSP70-肽復(fù)合物可誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生記憶T細(xì)胞反應(yīng)。HSP70-肽復(fù)合物在腎癌[7]和黑色素瘤[8]的免疫治療中已取得了良好的效果。黃波等[9]的研究表明，H22腫瘤混合抗原肽經(jīng)過(guò)HSP70提呈后能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且還可與其他因素配合產(chǎn)生良好的治療效果。

本實(shí)驗(yàn)中，筆者利用肝癌組織提取HSP70-肽復(fù)合物，激活T淋巴細(xì)胞，并觀察激活T淋巴細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果顯示肝癌HSP70-肽復(fù)合物激活T淋巴細(xì)胞對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用。

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