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    廣東省東莞地區(qū)發(fā)現(xiàn)1株泛耐藥產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌

    2013-08-23 03:01:36張小兵楊維青張麗華張菊芬朱學(xué)海朱凱欣
    中國感染與化療雜志 2013年6期
    關(guān)鍵詞:米卡烯類克雷伯

    張 麗,張小兵,楊維青,黃 娟,張麗華,張菊芬,朱學(xué)海,朱凱欣,周 靜

    肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的常見病原菌之一,其耐藥的主要原因是細(xì)菌產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺酶,主要是產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶和質(zhì)粒AmpC酶,有些菌株2種酶同時(shí)存在,導(dǎo)致對(duì)多種抗菌藥物耐藥[1]。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用,出現(xiàn)了對(duì)其耐藥的肺炎克雷伯菌。國內(nèi)報(bào)道臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌,其主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶,以華東地區(qū)報(bào)道的較多[2]。日前,我院在1例ICU患者的痰液中分離到泛耐藥產(chǎn)KPC-2β內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌,現(xiàn)報(bào)道如下。

    材料與方法

    一、材料

    (一)菌株來源 中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院ICU患者的痰標(biāo)本中分離到1株肺炎克雷伯菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、產(chǎn)KPC-2型的質(zhì)控菌2105(由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所胡付品博士惠贈(zèng))。

    (二)主要儀器與試劑 VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌分析鑒定系統(tǒng)為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。藥敏紙片亞胺培南(10μg)、美羅培南(10μg)、阿米卡星(30μg)、左氧氟沙星(5μg)、環(huán)丙沙星(5μg)、哌拉西林(100μg)、哌拉西林-他唑巴坦(100-10 μg)、氨曲南(30μg)、頭孢他啶(30μg)、頭孢曲松(30μg)、頭孢吡肟(30μg)、頭孢西?。?0μg)、甲氧芐啶-磺胺甲口惡唑(1.25-23.75μg)及藥敏 MH培養(yǎng)基購自英國OXOID公司。PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。DYY-6C型電泳儀、WD-9403C紫外儀為北京市六一儀器廠。細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、PCR檢測(cè)試劑盒均為大連寶生物科技有限公司 產(chǎn) 品。引 物[3]blakpcF5′-GCT ACA CCT AGC TCC ACC TTC-3′blakpc R5′-ACA GTG GTT GGT AAT CCA TGC-3′由生工生物工程(上海)有限公司合成。

    二、方法

    (一)菌株分離與鑒定 按常規(guī)方法從臨床標(biāo)本分離細(xì)菌,獲純培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭染色和氧化酶試驗(yàn),根據(jù)革蘭染色和氧化酶結(jié)果選擇革蘭陰性鑒定卡,在VITEK2全自動(dòng)微生物分析儀上進(jìn)行菌種鑒定,操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

    (二)藥敏試驗(yàn) 選用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法,挑取一定量細(xì)菌配成0.5麥?zhǔn)媳葷岬木海鶆蛲坎加贛H平皿上,室溫干燥3~5 min。貼細(xì)菌藥敏紙片,各紙片中心大于24 mm,紙片距離平皿邊緣應(yīng)大于15 mm。置35℃孵育16~18 h后讀取結(jié)果,參照 CLSI 2011年版標(biāo)準(zhǔn)判讀[4]。

    (三)耐藥表型檢測(cè) 采用改良的Hodge試驗(yàn)檢測(cè)待檢菌的耐藥表型[4]。用大腸埃希菌ATCC 25922以生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)菌懸液,按常規(guī)K-B法程序接種MH平皿,使平皿干燥5 min,在直徑90 mm平皿中央放置亞胺培南(10μg)紙片1張。然后使用10μL接種環(huán)挑取在血平皿過夜生長的3~5個(gè)試驗(yàn)菌落,從紙片邊緣向外劃直線接種。劃線至少25 mm長,孵育24 h后,檢查 MH平皿,在抑菌環(huán)與試驗(yàn)菌株交叉處是否出現(xiàn)增強(qiáng)生長。

    (四)模板制備與PCR擴(kuò)增及測(cè)序 煮沸裂解法制備模板DNA,PCR篩選KPC-2基因,所用引物及方法參照文獻(xiàn)[3]。PCR法擴(kuò)增KPC-2基因的反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃5 min,變性94℃30 s,退火52℃30 s,延伸72℃1 min,共35個(gè)循環(huán),再延伸72℃7 min,4℃保存10 min,即可電泳檢驗(yàn)結(jié)果。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,將1μL的核酸染料(將原液用0.5×TBE電泳緩沖液稀釋10倍)與5μL的Marker2000混勻取3μL加入凝膠孔中作參照;將1μL核酸染料、1μL的6×Loading buffer和4μL的PCR產(chǎn)物混勻取3μL上樣。110 V電泳35 min,溴化乙靛染色15 min,洗脫后放凝膠成像系統(tǒng)成象,觀察結(jié)果。以肺炎克雷伯菌ATCC700603作陰性對(duì)照,KPC-2陽性菌株2105作陽性對(duì)照。產(chǎn)物經(jīng)純化、膠回收后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢比對(duì)。

    結(jié) 果

    一、細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)

    經(jīng)鑒定該菌為肺炎克雷伯菌,細(xì)菌鑒定可信度99%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,除對(duì)阿米卡星敏感外,對(duì)亞胺培南 、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦和其他常用抗菌藥物均耐藥。

    二、改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)待檢菌的耐藥表型

    大腸埃希菌(ATCC25922)抑菌環(huán)與痰標(biāo)本分離到泛耐藥肺炎克雷伯菌在交叉處出現(xiàn)增強(qiáng)生長,而對(duì)照菌株在交叉處未出現(xiàn)增強(qiáng)生長。見圖1。

    三、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

    PCR產(chǎn)物GenBank Blast程序分析,該序列與KPC-2(GenBank11844849號(hào))的核苷酸序列同源性為100%。PCR擴(kuò)增檢測(cè)到KPC-2基因,序列長度為920 bp。見圖2。

    圖1 產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌Hodge試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Results of Hodge test for production of KPC-2 carbapenemase in Klebsiella pneumoniae

    圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 2 Results of electrophoresis for PCR products

    四、臨床病史調(diào)查分析

    該患者男性,52歲,因“鼻咽癌放療后17年余,咳嗽2 d,高熱1 d”入住我院ICU。入院診斷:①社區(qū)獲得性肺炎(重癥),急性呼吸衰竭;②血流感染(肺炎鏈球菌),膿毒性休克;③支氣管擴(kuò)張。入院后予以嚴(yán)密監(jiān)測(cè)生命體征,積極抗感染治療等處理,并行氣管插管、機(jī)械通氣治療。曾用頭孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、左氧氟沙星、亞胺培南等抗菌藥物。2012年3月8日,痰培養(yǎng)示泛耐藥肺炎克雷伯菌,予替加環(huán)素和阿米卡星抗感染,停用呼吸機(jī),入住隔離病房,加強(qiáng)支持治療后,1個(gè)月內(nèi)2次痰培養(yǎng)均未檢出肺炎克雷伯菌。

    討 論

    碳青霉烯類抗生素對(duì)革蘭陰性菌的抗菌譜廣,抗菌活性強(qiáng),是治療醫(yī)院嚴(yán)重感染常用藥,尤其適用于產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶或AmpC酶腸桿菌科細(xì)菌的嚴(yán)重感染。隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上廣泛使用,出現(xiàn)了耐藥菌株。目前,引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的最常見原因是碳青霉烯酶的產(chǎn)生,尤其以產(chǎn)KPC酶最為常見。KPC酶最早在1株亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn),是一種新型碳青霉烯酶,屬于Bush分類的A組2f亞組絲氨酸酶。此類酶能夠水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素,克拉維酸對(duì)酶活性作用不確定[3]。目前發(fā)現(xiàn)11個(gè)KPC亞型,并在美國,特別是美國東北部各州蔓延,造成局部暴發(fā)和流行[5];在我國,產(chǎn) KPC-2酶的細(xì)菌以華東地區(qū)報(bào)道較多[2]。回顧東莞地區(qū)以往的耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),未發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類的腸桿菌科細(xì)菌[6-7]。此次發(fā)現(xiàn)的1株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌經(jīng)過PCR檢測(cè),其耐藥基因及測(cè)序發(fā)現(xiàn)為產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶,與我國其他地區(qū)報(bào)道的型別相同[2]。

    碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌往往對(duì)臨床常用的抗菌藥物呈現(xiàn)耐藥。胡付品等[2]報(bào)道的中國CHINET2010年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌除對(duì)阿米卡星和米諾環(huán)素的耐藥率分別為52.6%和37.0%外,對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%~100%。Hirsch等[8]報(bào)道,治療由碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌引起的感染,可選用氨基糖苷類聯(lián)合黏菌素或替加環(huán)素的治療方案。本研究發(fā)現(xiàn),該肺炎克雷伯菌除對(duì)阿米卡星敏感外,對(duì)其他測(cè)試抗菌藥物均耐藥。臨床根據(jù)藥敏結(jié)果改用替加環(huán)素聯(lián)合阿米卡星,并拔除氣管插管及對(duì)癥處理后,病情好轉(zhuǎn),且1個(gè)月內(nèi)連續(xù)2次痰培養(yǎng)均未檢出肺炎克雷伯菌。

    Patel等[9]的研究表明,患者免疫狀態(tài)、入住ICU、長期住院以及廣譜抗菌藥物的應(yīng)用是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌感染或定植的危險(xiǎn)因素。本次是在1例入住ICU,免疫功能低下的鼻咽癌化療患者中分離出該菌株,臨床依據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果合理應(yīng)用抗生素及對(duì)癥治療后,細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰,也未引起醫(yī)院內(nèi)播散。

    因此,臨床依據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗菌藥物、加強(qiáng)醫(yī)院感染控制措施,可遏制耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。

    [1] 胡付品,葉信予,吳培澄,等.2005年上海華山醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國感染與化療雜志,2007,7(4):332-337.

    [2] 胡付品,朱德妹,汪復(fù),等.CHINET監(jiān)測(cè)2010年碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌的分布特點(diǎn)和藥物敏感性[J].中國感染與化療雜志,2013,13(1):1-7.

    [3] Smith Moland E,Hanson ND,Herrera VL,et al.Plasmid-mediated,carbapnem-h(huán)ydrolysingβ-lactamase,KPC-2,in Klebsiella pneumoniaeisolates[J].J Antimicrob Chemother,2003,51(3):711-714.

    [4] Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].Twentieth Informational Supplement,2011,M100-S21.

    [5] Woodford N,Tierno PM Jr,Young K,et al.Outbreak ofKlebsiella pneumoniae producing a new carbapenem—hydrolyzing class A beta-lactamase,KPC-3,in a New York Medical Center[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(12):4793-4799.

    [6] 張麗華,張麗,李超強(qiáng),等.東莞東華醫(yī)院2007年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國感染與化療雜志,2008,8(5):379-382.

    [7] 張麗,張麗華,張小兵.2009年中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國感染與化療雜志,2011,11(5):375-380.

    [8] Hirsch EB,Tam VH.Detection and treatment options for Klebsiella pneumoniae carbapenemases(KPCs):an emerging cause of multidrug-resistant infection[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(6):1119-1125.

    [9] Patel G,Huprikar S,F(xiàn)actor SH,et al.Outcomes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection and the impact of antimicrobial and adjunctive therapies[J].Infect Control Hosp Epidemiol,2008,29(12):1099-1106.

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