兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

劉 康，白亦光，陳 竹，韓小偉，楊澤龍，趙 明，宋桂芹，馮 剛

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，四川南充 637007)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類來源于骨髓組織的具有強大增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞［1］，具有向中胚層組織及神經(jīng)外胚層組織分化的能力，在不同的誘導(dǎo)條件下能分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其來源廣、容易獲取、無醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭議等優(yōu)勢，被認(rèn)為是目前骨組織工程最為理想的種子細(xì)胞來源［2-3］。本研究對BMSCs的原代培養(yǎng)技術(shù)進行探討，旨在摸索出一種更為簡便有效的獲取更高純度和更多數(shù)量BMSCs的培養(yǎng)方法，同時觀察BMSCs在體外環(huán)境培養(yǎng)下的生物學(xué)特性，從而解決骨組織工程研究中種子細(xì)胞來源的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生2～3周的新西蘭兔5只，雌雄不限，質(zhì)量0.4～0.6 kg，由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自Hyelone公司。PercoⅡ分離液購自博士德生物公司。噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自GIBCO公司。β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素c、胰島素、番紅、快綠、素木精等購自Sigma公司、DAB試劑盒購自碧云天公司。CO2培養(yǎng)箱、高速離心機購自Thermo公司。倒置相差顯微鏡購自NIKON公司。

1.3 方法

1.3.1 兔BMSCs的分離與培養(yǎng) 取1月齡新西蘭大白兔(雌雄不限)，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸泡消毒15～20 min后無菌操作下切開后肢皮膚、肌肉，去盡附著在骨上的肌肉、筋膜等軟組織，分離出股骨和脛骨。用眼科剪從股骨和脛骨的干骺端打開骨髓腔，用含有適量肝素(625 U/mL)的DMEM液沖洗骨髓腔，收集沖洗液約6～8 mL。吸管反復(fù)吹打后，1 500 r/min，離心5 min，棄上清。加入DMEM培養(yǎng)基4 mL重懸，將上述細(xì)胞重懸液按照1∶1的比例緩慢滴加到密度為1.073 g/mL的PercoⅡ分離液中，1 500 r/min離心30 min。離心后管內(nèi)容物分為3層，收集中間乳白色云霧狀的單個核細(xì)胞層，加入DMEM培養(yǎng)液稀釋混勻，1 500 r/min離心5 min，洗滌2～3次，去除多余的脂肪細(xì)胞及組織液。用含雙抗的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2.0×105個/cm2的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.3.2 BMSCs的純化和擴增 利用差異貼壁培養(yǎng)法純化細(xì)胞。第1次于48 h后棄掉未貼壁的細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液。以后每3天換液1次。待細(xì)胞長到80%融合，用0.25%胰蛋白酶1 mL消化，血清終止后，將消化后的細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含胎牛血清10%，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，靜置1 min后，將上清液以8.0×104個/cm2的細(xì)胞密度移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，5%CO2，pH 7.5，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置相差顯微鏡逐日觀察體外培養(yǎng)原代及傳代BMSCs的生長、增殖及形態(tài)特征，并拍照記錄。

1.3.4 生長曲線的繪制 分別取第1、3代和第8代細(xì)胞，胰蛋白酶消化，血清終止，培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×104/mL。接種于96孔板中，每孔200 μL。待細(xì)胞完全貼壁后(約24 h)后更換無血清DMEM培養(yǎng)基，24 h后，將培養(yǎng)液換為含10%FBS的 DMEM完全培養(yǎng)液，于37℃、100%濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，適時換液。每天固定時間隨機抽取5孔細(xì)胞，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，吸凈孔內(nèi)液體，每孔中加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫測定儀上用波長為490 nm的濾光片測定每孔的吸光度，直至貼壁細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔底部，取5孔吸光度均值，以時間(d)為橫坐標(biāo)，吸光度(OD)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.5 細(xì)胞貼壁率檢測 取第1、3、5代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成5×107/L的細(xì)胞懸液接種于24孔板中，每隔2 h隨機選取3個培養(yǎng)孔，吸取培養(yǎng)液與未貼壁細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，計算每孔細(xì)胞數(shù)，取均值，連續(xù)測定20 h，計算細(xì)胞貼壁率。

1.3.6 成軟骨細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化 將第3代的細(xì)胞懸液以105個/cm2細(xì)胞濃度接種24孔培養(yǎng)板中，各孔加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基、50 mg/L維生素 C、0.272 g/L L-谷氨酰胺、6.25 mg/L 胰島素、6.25 mg/L亞硒酸、1.25 g/L牛血清白蛋白、1 mmol/L丙酮酸鹽、5.35 mg/L亞油酸、10 mg/L轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β、10～7 mol/L地塞米松)，每3天全量換液。誘導(dǎo)2周后進行番紅快綠染色及甲苯胺藍(lán)染色。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

剛接種的細(xì)胞鏡下呈圓形，大小較均一，24 h后見部分貼壁的細(xì)胞呈梭型或三角形，視野中有較多懸浮的紅細(xì)胞。3 d后，細(xì)胞逐漸鋪開，出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細(xì)胞，且呈克隆樣生長，10～14 d后形成克隆，快速分裂增殖形成細(xì)胞團簇，呈放射狀排列，直徑大小不等。細(xì)胞貼壁稀疏時，細(xì)胞輪廓呈長梭形，細(xì)胞的兩極朝向不規(guī)律，細(xì)胞排列混亂，少量細(xì)胞呈星形，胞漿豐富。隨著培養(yǎng)時間的延長，這些貼壁細(xì)胞形成集落，集落大小不一，此時細(xì)胞的兩極開始有規(guī)律的排列成束狀(圖1)。

2.2 傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

傳代細(xì)胞為梭形、多角形，平鋪生長，不再形成明顯集落，分布均勻。傳代后細(xì)胞生長迅速，約2～3 d細(xì)胞融合可達(dá)90%，呈旋渦狀排列。傳代后細(xì)胞形態(tài)上無明顯改變，隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞開始老化，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楸馄?、寬大、遮光性差，增殖速度明顯減慢直至停止。

2.3 兔BMSCs的生長曲線

經(jīng)MTT法測定細(xì)胞活性并繪制細(xì)胞增殖曲線，對比第1、3、5代細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線可發(fā)現(xiàn)，各代細(xì)胞均有24～48 h的潛伏期，一般從第48 h后進入對數(shù)生長期，生長迅速，第6～7天即可達(dá)單層融合進入平臺期，第9天后細(xì)胞出現(xiàn)生長抑制(圖2)。

2.4 細(xì)胞貼壁率

隨著培養(yǎng)時間的延長，MSCs貼壁率逐漸上升，第1、3代細(xì)胞貼壁率基本無差異，接種12 h后貼壁率分別為96%和95%。第5代細(xì)胞貼壁能力較第1代、第3代細(xì)胞略有下降，為90%(圖3)。

2.5 成軟骨誘導(dǎo)

加入成軟骨誘導(dǎo)液后，細(xì)胞擴增速度明顯減緩甚至停止，在培養(yǎng)的第7天少量細(xì)胞由長梭形漸變?yōu)槎嘟切位蛄⒎叫?，隨著時間的延長，多角形的細(xì)胞增多并聚集成團。經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色和番紅快綠染色后，可見細(xì)胞表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞特征，細(xì)胞外基質(zhì)極其豐富(圖4)。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離培養(yǎng)，在體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種功能細(xì)胞，在組織工程、細(xì)胞替代治療、基因治療等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。但是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中含量稀少，僅占有核細(xì)胞總量的0.001% ～0.01%［4］，所以對其進行分離純化就顯得尤為重要。目前用于分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法和免疫學(xué)方法等［5］。免疫學(xué)法有較高特異性，但所需成本高，在實際應(yīng)用中受到限制。密度梯度離心法獲取的細(xì)胞活性下降、數(shù)量減少，不利于細(xì)胞的生長，因此，這兩種方法在應(yīng)用中均受到不同程度的限制。本實驗采用貼壁法，選取新生兔，無菌條件下獲取股骨，進入骨髓腔得到細(xì)胞，將其離心后直接加入培養(yǎng)瓶中，為了去除原代培養(yǎng)中混雜的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、造血細(xì)胞和紅細(xì)胞等，利用BMSCs可在早期貼壁而血細(xì)胞不貼壁的特性，通過培養(yǎng)一定時間后更換細(xì)胞培養(yǎng)液來去除接種后混合細(xì)胞中未貼壁的血細(xì)胞，對于貼壁細(xì)胞，根據(jù)其粘附能力與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附能力不同，通過調(diào)整胰蛋白酶的消化時間，保證骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在短時間內(nèi)與培養(yǎng)瓶分離，而巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和造血細(xì)胞等仍貼附于培養(yǎng)瓶底，來分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。步驟簡單，易于操作，純化效果好。細(xì)胞形態(tài)均一。該培養(yǎng)方法簡單、有效，分離獲得細(xì)胞純度較高，細(xì)胞活性好。

本實驗對第1、3、5代的兔BMSCs的貼壁率及生長特性進行研究，發(fā)現(xiàn)第1代和第3代細(xì)胞的形態(tài)基本相同，貼壁率較高，細(xì)胞生長曲線也均為類S形。而第5代細(xì)胞在貼壁特性及增殖能力方面均較第1代和第3代有所降低，但變化不大。一般細(xì)胞生長均經(jīng)歷了潛伏期、對數(shù)期和平臺期。這個現(xiàn)象提示在進行組織工程研究時最好選取第1至第3代的BMSCs作為種子細(xì)胞，以保證其與骨組織工程支架材料復(fù)合時獲得良好的固位。

目前沒有鑒定干細(xì)胞的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，絕大部分的學(xué)者都是從細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表型，細(xì)胞功能三大方面來檢驗干細(xì)胞特性［6］。實驗中發(fā)現(xiàn)，本方法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種形態(tài)類似成纖維樣集落生長的細(xì)胞，與文獻(xiàn)報道一致［7］。對于干細(xì)胞的實際應(yīng)用而言，是否保持多分化潛能至關(guān)重要。本實驗對分離到的細(xì)胞進行的成軟骨誘導(dǎo)，結(jié)果表明，采用我們的分離培養(yǎng)方法，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，完全能夠滿足應(yīng)用的需要。

綜上所述，全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種比較理想的分離、純化和擴增MSCs的方法，這為將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，進一步定向誘導(dǎo)分化應(yīng)用于組織工程生物材料構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

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［2］ Seong JM，Kim BC，Park JH，et al.Stem cells in bone tissue engineering［J］.Biomed Mater，2010，5(6):11-33

［3］ 田詩政，楊志宏，馮國華，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和鑒定［J］.西部醫(yī)學(xué)，2011，23(12):2303-2306

［4］ 石 云，張曉英.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外分離擴增及鑒定［J］.長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，26(3):164-166

［5］ 黃家志，陳前芬，肖增明，等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，28(1):8-12

［6］ Kemp KC，Hows J，Donaldson C.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Leuk Lymphoma，2005，46(11):1531-1544

［7］ Chanda D，Kumar S，Ponnazhagan S.Therapeutic potential of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells in diseases of the skeleton［J］.J Cell Biochem，2010，111(2):249-257