河南漢族原發(fā)性高血壓患者MTHFR基因C677T多態(tài)性位點檢測

姚 蕊 張會敏 張俊蕾 李冬貝 范陽陽

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院護理學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來，同型半胱氨酸(Hcy)已被證實是心腦血管疾病的獨立危險因子，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是 Hcy代謝的關(guān)鍵酶之一，該基因C677T位點突變與各種心腦血管疾病的關(guān)系的研究較多，但存在分歧〔1～4〕，而與原發(fā)性高血壓(EH)的關(guān)系研究尚不多見。本研究采用病例對照研究的方法，收集(EH)患者150例和與之年齡及性別匹配的對照150例，對MTHFR基因C677T多態(tài)性進行檢測，探討二者的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2008年10月至2010年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院住院150例EH患者作為病例組，選取年齡、性別相匹配的150例同期住院患其他疾病患者或體檢中心健康志愿者作為對照組。病例組患者均符合WHO關(guān)于EH的診斷標準，即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg，年齡52～78歲，平均年齡(63.4±6.32)歲，男87例，女63例。排除繼發(fā)性高血壓、心臟病、糖尿病、腎臟病等患者。對照組年齡51～81歲，男85例，女65例。兩組在性別、年齡、收入、吸煙、飲酒等方面匹配，沒有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料問卷調(diào)查 采用自編問卷，調(diào)查兩組性別、年齡、收入、吸煙、飲酒等一般情況。

1.2.2 一般生化指標、葉酸和同型半胱氨酸的檢測 采用全自動生物化學分析儀測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)數(shù)值。采用化學發(fā)光法測定也葉酸水平。應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)法測定血液中Hcy:采用Agilent1100液相色譜儀，色譜柱為 Hypersil C18柱(46 mm，250 mm，5 m);流動相為0.04 mol/L醋酸緩沖液，流速0.8 ml/min;進樣量20μl;柱溫25℃;分析時間15 min;熒光檢測條件:激發(fā)波長382 nm，發(fā)射波長470 nm。樣本兩次測定值誤差不超過15%。Hcy正常值設(shè)定在＜10 mol/L，超過10 mol/L定義為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)〔2〕。

1.2.3 DNA的提取和濃度測定 抽取每名患者空腹外周靜脈血4 ml于EDTA抗凝管中，存放于－20℃冰箱中。集中提取DNA。用人全血DNA提取試劑盒(購于德國BMS公司)提取DNA后，存放于－20℃ 。用核酸蛋白濃度測定儀測定抽提基因組DNA濃度，并將保存的基因組模板DNA原液用 DNA溶解液稀釋(GEN TRA公司Puregene試劑盒)至終濃度為5～10 ng/μl。

1.2.4 MTHFR基因型測定 采用聚合酶鏈式反應(yīng)限制性酶切片段長度多態(tài)性分析法，擴增引物序列如下:上游 5'-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3'和下游5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系25μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200μmol/L、正反引物各0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA 5μg。PCR擴增條件如下:94 ℃5 min，94 ℃30 s，56 ℃40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)，末次延伸7 min;取8μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加4 U限制性內(nèi)切酶 HinfⅠ，反應(yīng)體積20μl，酶切4 h。取8μl酶切產(chǎn)物，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，溴乙啶(EB)染色30 min，UVP凝膠成像系統(tǒng)攝像判斷基因型。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料進行非配對t檢驗及方差分析，計數(shù)資料和Hardy-Weinberg平衡檢驗均采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組生化指標、葉酸、Hcy水平比較 兩組血糖、血脂相比，沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)病例組葉酸水平低于對照組(P＜0.05)，病例組Hcy水平明顯高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組血糖、血脂水平比較(x±s)

2.2 病例組和對照組MTHFR基因型和等位基因頻率比較由圖1可見，PCR擴增產(chǎn)物片段為246 bp，HinfⅠ酶切結(jié)果顯示MTHFR基因型有3種，分別為野生型(C/C)、雜合子型(C/T)、純合子突變型(T/T)，包含C等位基因的246 bp的片段不被HinfⅠ酶切，含T等位基因的片段被HinfⅠ酶切為174 bp和72 bp的兩個片段。病例組MTHFR(C677T)基因CC基因型頻率分別為21.3%、CT基因型頻率為46.0%、TT基因型頻率為32.7%，T等位基因頻率為55.7%，C等位基因頻率為44.3%;對照組MTHFR(C677T)基因CC基因型頻率分別為40.7%、CT基因型頻率為44.7%、TT基因型頻率14.6%，T等位基因頻率為37.0%，C等位基因頻率為63.0%。見表2。

圖1 PCR-RFLP電泳結(jié)果

表2 病例組和對照組MTHFR(C677T)基因型和等位基因頻率〔n(%)〕

3 討論

高血壓分為EH和繼發(fā)性高血壓，在大多數(shù)患者中，高血壓的病因不明，稱為EH，占高血壓總數(shù)的95%以上。關(guān)于高血壓發(fā)病機制的研究主要從環(huán)境和遺傳兩個方面，有研究表明MTHFR基因C677T多態(tài)性與高血壓關(guān)系密切〔4，5〕，并且與血漿中Hcy水平關(guān)系密切，但因為不同種族、不同地區(qū)高血壓的發(fā)病率也有明顯的差異，且河南豫北地區(qū)高血壓的發(fā)病較高，且沒有其與MTHFR基因C677T多態(tài)性的研究，因此我們從一般資料進行問卷調(diào)查，并進行生化指標的檢測，發(fā)現(xiàn)EH與血糖、血脂水平無關(guān)，而與Hcy水平關(guān)系密切，病例組Hcy平均水平明顯高于對照組，且葉酸水平明顯低于對照組。我們的研究結(jié)果支持Hcy是心血管疾病的獨立危險因素的傳統(tǒng)觀點，Hcy代謝過程中有一個關(guān)鍵酶就是MTHFR，因此越來越多的人開始關(guān)注Hcy水平與MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系，且大多集中在C677T位點，但研究結(jié)果并不一致，有研究表明該位點突變可引起Hcy水平升高〔6〕，國外的研究也有相同的觀點。這與國外研究結(jié)果一致〔7〕，但也有報道認為 Hcy水平與 MTHFR基因C667T多態(tài)性無相關(guān)性〔8〕。本研究結(jié)果顯示，病例組T等位基因和T/T型分布頻率均高于對照組，提示C677T突變與河南豫北地區(qū)漢族人群EH發(fā)生有著密切關(guān)系，可能是其發(fā)病的遺傳危險因素之一。

1 Sacoo RL，Adams R，Albers G，et al.Guidelines for prevention of stroke in patients with ischemic stroke or transient ischemic attack:a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association Council on Stroke:cosponsored by the Council on Cardiovascular Radiology and Intervention:the American Academy of Neurology affirms the value of this guideline〔J〕.Stroke，2006;37(2):577-617.

2 Trabetti E.Homocysteine，MTHFR gene polymorphisms，and cardio cerebrovascular risk〔J〕.JAppl Genet，2008;49(3):267-82.

3 Nahar，Akash Sabo，Cynthia CPNP，et al.Plasma homocysteine levels，methylene tetrahydrofolate reductase polymorphisms，and the risk of thromboembolism in children〔J〕.J Pediatric Hematol Oncol，2011;33(5):330-3.

4 王 紅，武貴臻，張 穎，等.新疆哈薩克族人群同型半胱氨酸及其代謝酶基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2010;14(33):6247-52.

5 宗永華，李小鷹，陳光亮，等.同型半胱氨酸水平與N5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性的關(guān)系〔J〕.臨床心血管病雜志，2011;27(3):203-7.

6 宗永華，徐希平，霍 勇，等.影響安慶農(nóng)村地區(qū)H型高血壓發(fā)生的遺傳和環(huán)境因素〔J〕.中華高血壓雜志，2011;19(5):445-9.

7 Gueantrodriguez RM，Juilliere Y，Candito M，et al.Association of MTRR A66G polymorphism(but not of MTHFR C677T and A1298C，MTR A2756G，TCN C776G)with homocysteine and coronary artery disease in the French population〔J〕.Thromb Haemost，2005;94(3):510-5.

8 Muniz MT，Siqueira ER，F(xiàn)onseca RA，et al.Evaluation of MTHFR c677t gene polymorphism and homocysteine level in coronary atherosclerotic disease〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2006;50(6):1059-65.