SHP－2和轉(zhuǎn)化生長因子β在中老年患者宮頸鱗癌組織中的表達(dá)

宋 利

(沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110024)

腫瘤的發(fā)生與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)〔1〕。蛋白酪氨酸磷酸酶是一種經(jīng)典的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用，并在許多生理調(diào)節(jié)過程中也具有重要作用，其主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸的磷酸化水平來調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化、代謝、遷移、適應(yīng)、防御、基因轉(zhuǎn)錄和凋亡等〔2〕。目前有證據(jù)表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B與腫瘤具有相關(guān)性〔3〕。SHP-2是一種非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與多種疾病包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔4〕。大量研究提示，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)可能參與了宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展〔5～7〕。而 SHP-1/2 能夠調(diào)節(jié) TGF-β 介導(dǎo)的信號分子(如src kinases)的活性〔8，9〕，基于此，課題組假設(shè) SHP-2 在宮頸癌的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)技術(shù)從蛋白和基因水平觀察正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)腫瘤(CIN)和宮頸鱗癌組織中SHP-2和TGF-β的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 納入2009年7月至2012年4月在沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院婦產(chǎn)科住院治療的患者。其中宮頸鱗癌患者120例，年齡45～72歲，平均(43±5)歲;CIN患者80例，年齡42～72歲，平均(45±4)歲;宮頸正?；颊?0例，年齡43～67歲，平均(42±3)歲。所有患者在取材前均未經(jīng)任何治療，均經(jīng)病理診斷證實(shí)，排除宮頸腺癌患者。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色檢測宮頸組織SHP-2和TGF-β的表達(dá)取宮頸組織，10%甲醛固定后，脫水，浸蠟，包埋，行4μm厚連續(xù)切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后微波修復(fù)抗原;3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;在兔抗SHP-2和TGF-β多克隆抗體(1∶500;Santa Cruz公司)中4℃孵育過夜;生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG中孵育2 h(37℃);DAB顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗，返藍(lán);梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。每例標(biāo)本隨機(jī)取3個(gè)視野(100倍)，應(yīng)用 Image-Pro Plus圖像分析軟件測量 SHP-2和TGF-β的IOD，取平均值。

1.2.2 實(shí)時(shí)RT-PCR檢測宮頸癌組織SHP-2 mRNA的表達(dá)按Trizol試劑說明提取各組宮頸標(biāo)本組織細(xì)胞總RNA，并檢測RNA完整性和純度，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。根據(jù) GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)的人SHP-2 mRNA序列，以primer5.0設(shè)計(jì)其上、下游引物序列。SHP2:上游:5'-GGA GGG CGG GAG GAA CAT GAC ATC-3'，下游:5'-GGG AGA GGG TGA AAG TCC ACA TCT AT-3';β-actin:上游 5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'，下游:5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3'。利用特異引物和PCR擴(kuò)增試劑盒分別合成SHP-2和β-actin基因。PCR反應(yīng)條件:94℃，預(yù)變性 5 min。94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。72℃延伸10 min。應(yīng)用 Rotor-Gene 3000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(香港基因有限公司)的Comparative Delta-delta Ct法對獲得的熒光曲線結(jié)果進(jìn)行分析，以同一樣品目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物和內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物的比值確定目的基因的表達(dá)水平。

1.2.3 Western印跡法檢測宮頸癌組織SHP-2蛋白的表達(dá)分別取各組宮頸標(biāo)本組織，用細(xì)胞裂解液提取蛋白，Bradford方法測蛋白濃度;調(diào)節(jié)蛋白濃度一致，取等量蛋白樣品，行SDSPAGE電泳分離蛋白，然后用半干式電轉(zhuǎn)的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白37℃封閉2 h，1∶200的兔抗SHP-2單克隆抗體中4℃孵育過夜;生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG中37℃孵育2 h，DAB顯色，見有清晰條帶出現(xiàn)即用雙蒸水終止顯色。所得圖像用掃描儀掃描，應(yīng)用北京航天航空大學(xué)CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量條帶的吸光度值，將目的蛋白吸光度值與GAPDH的比值作為結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織TGF-β的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示在正常宮頸組織僅有個(gè)別標(biāo)本中可見TGF-β的表達(dá)，顯示出弱的棕黃色，主要集中在胞質(zhì);CIN標(biāo)本中TGF-β陽性表達(dá)的數(shù)量較正常宮頸標(biāo)本多，但染色依舊較弱;宮頸鱗癌組織TGF-β陽性標(biāo)本數(shù)目明顯增多，染色也相對較深，見圖1。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件對所有標(biāo)本TGF-β的IOD值進(jìn)行測量，結(jié)果顯示在正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織，TGF-β的表達(dá)分別為(0.934 ±0.652)，(2.673 ±0.638)，(3.784±0.538)，三者間兩兩比較差異顯著(P＜0.05)。

圖1 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織TGF-β的表達(dá)(免疫組化染色，×100)

2.2 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2的分布與表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示SHP-2的表達(dá)以胞質(zhì)染色陽性為主，也有少許胞核染色陽性，見圖2。與正常宮頸組織比較，CIN及宮頸鱗癌組織中SHP-2的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，且宮頸鱗癌組織中SHP-2的表達(dá)明顯高于CIN(P＜0.05)，見表1。

2.3 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2 mRNA的表達(dá)宮頸鱗癌組織中SHP-2 mRNA表達(dá)最高，其次是CIN，在正常宮頸中表達(dá)最低，見表1。

圖2 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2的表達(dá)(免疫組化染色，×100)

表1 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2蛋白及mRNA的表達(dá)(x±s)

2.4 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2蛋白的表達(dá)Western印跡可見，在正常宮頸組織中幾乎看不到SHP-2蛋白的表達(dá)，而在宮頸鱗癌組織中SHP-2蛋白條帶較深，表達(dá)最多，CIN組織中的SHP-2蛋白條帶介于正常宮頸和宮頸鱗癌組織之間，見圖3，三者間兩兩比較差異顯著(P＜0.05)，見表1。

圖3 Western印跡檢測正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2的表達(dá)

3 討論

SHP-2是一種由PTPNII基因編碼的廣泛分布在胞漿中的蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2個(gè)SH結(jié)構(gòu)域和1個(gè)催化功能結(jié)構(gòu)域。其作為細(xì)胞因子、生長因子及其他胞外刺激因素的下游信號分子參與了細(xì)胞的增殖、分化、死亡等過程〔10〕。同時(shí)一些研究發(fā)現(xiàn)，其與一些癌癥密切相關(guān)。然而趙碩〔11〕對癌癥組織中SHP-2 mRNA水平進(jìn)行檢測并未發(fā)現(xiàn)SHP-2在癌癥組織及正常組織中表達(dá)明顯差異，發(fā)現(xiàn)了與其同源性較高的pseudo基因的差異表達(dá)。但也有研究顯示〔12〕，在人體幾種主要器官，包括肺癌、胃癌、卵巢癌、直腸癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等的正常和癌變組織中，SHP-2在蛋白和mRNA水平上均產(chǎn)生了差異表達(dá)。且研究發(fā)現(xiàn)其在一些惡性腫瘤中高度活化，可能與癌癥的發(fā)生離不開信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變有關(guān)。而SHP-2在從細(xì)胞表面到細(xì)胞核的信號傳導(dǎo)通路中扮演重要角色，主要包括JAK-STAT途徑、Ras-MAPK途徑及PI3K途徑。而且SHP-2通過對細(xì)胞內(nèi)磷酸化的酪氨酸殘基去磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，而異常的增殖和分化正是腫瘤細(xì)胞的特征之一。

本研究發(fā)現(xiàn)SHP-2在宮頸鱗癌組織中表達(dá)最高，CIN組織次之，正常宮頸組織中表達(dá)最低，與孟斐〔13〕測得的SHP-2在宮頸癌患者血清中SHP-2的表達(dá)升高相一致。提示SHP-2參與了宮頸癌的發(fā)生，且與癌癥的分型密切相關(guān)。SHP-2的過度表達(dá)參與了宮頸癌的發(fā)生。

TGF-β是功能復(fù)雜的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、血管形成、細(xì)胞凋亡等多種功能，還參與細(xì)胞外基質(zhì)的重建、間質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生和機(jī)體抗腫瘤免疫等，因此其與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系〔14，15〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TGF-β1在宮頸鱗癌組織中表達(dá)最高，CIN組織次之，正常宮頸中表達(dá)最低，驗(yàn)證了TGF-β在宮頸癌形成中的作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)從蛋白和基因水平證實(shí)了SHP-2在宮頸鱗癌組織高表達(dá)，可能參與了宮頸癌的形成及分型，并發(fā)現(xiàn)了SHP-2和TGF-β在宮頸癌組織中表達(dá)具有一致性，但具體的作用機(jī)制及信號調(diào)節(jié)通路還有待進(jìn)一步研究。

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