高效液相色譜法同時測定牛奶中的香蘭素與乙基香蘭素

林靈超，吳方圓

(浙江福立分析儀器有限公司，浙江溫嶺 317500)

香蘭素與乙基香蘭素是人工合成的香精，可增強食品口感，使其清香宜人[1]，是食品添加劑行業(yè)中不可缺少的重要原料，可直接應用于化妝品、香皂、香煙、糕點、糖果、餅干、奶粉以及烘烤食品中[2]。但大劑量使用香蘭素可以導致頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難，甚至損傷肝、腎，對人體有較大危害。

常見香蘭素與乙基香蘭素的分析方法有氣相色譜法[3–4]、分光光度法[5–6]、高效液相色譜(HPLC)法[7]、液相色譜 – 質(zhì)譜聯(lián)用[8]及其它方法[9–11]。筆者采用HPLC法同時測定香蘭素與乙基香蘭素，通過對牛奶樣品的簡單處理和流動相的優(yōu)化，使得方法操作簡單，精密度高，重復性好，可用于牛奶中香蘭素與乙基香蘭素的日常檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：FL2200–II型，浙江福立分析儀器有限公司；

色譜柱：Ultimate XB–C18型(4.6 mm×250 mm，5μm)，月旭材料科技(上海)有限公司；

超聲波清洗器：HS 2060型，浙江福立分析儀器有限公司；

電子分析天平：JA 2004型，上海雷韻公司；

甲醇：色譜純，美國J. T. Baker 公司；

磷酸：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司；

鹽酸、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

香蘭素、乙基香蘭素標準樣品：含量均不小于99.9%，國家標準物質(zhì)研究中心；

牛奶樣品：批號為20121001，市售；

實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的制備

分別取香蘭素與乙基香蘭素標準樣品各1 mL，以甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成100 mg／L的混合標準儲備液。精密移取0.5 mL混合標準儲備液，以流動相溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg／L的混合標準溶液，過濾，備用。

1.3 樣品溶液的配制

稱取牛奶樣品5 g，以25 mL 50℃熱水溶解，超聲 10 min，用 5 mol／L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)至 pH 1.7，放置5 min，再用2 mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 4.5，此時溶液變?yōu)閼覞嵋?，將此懸濁液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用純水定容至標線后倒入漏斗，用快速定性濾紙過濾，棄去初濾液，收集中間濾液，充分搖勻，過濾，備用。

1.4 色譜條件

流動相：甲醇–0.01 mol／L磷酸溶液(體積比為 30∶70)；流速：1.0 mL／min；檢測波長：276 nm ；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相組成

考察了乙腈–乙酸、乙腈–磷酸二氫鉀、甲醇–磷酸等流動相，雖然乙腈的洗脫能力強于甲醇，但其毒性較大，而且香蘭素與乙腈香蘭素的色譜峰形、分離度均不符合分析要求；而用甲醇–磷酸體系可以得到標準對稱的色譜峰形，因此選擇甲醇–磷酸體系作為流動相。

2.2 前處理方法

牛奶中的蛋白質(zhì)含量較高，因此樣品要先用50℃熱水超聲提取，再經(jīng)酸沉淀蛋白后進行測定。實驗結(jié)果表明：本方法加標回收率大于98%，且操作簡單，可以滿足牛奶中香蘭素與乙基香蘭素的檢測要求。

2.3 色譜圖

在1.4色譜條件下香蘭素與乙基香蘭素標準溶液及牛奶樣品的高效液相色譜圖見圖1，由圖1可知，香蘭素與乙基香蘭素分離良好、峰形對稱，符合分析要求。

2.4 精密度試驗

精密吸取香蘭素、乙基香蘭素混合標準溶液20 μL，按照1.4色譜條件連續(xù)進樣6次，分別測定香蘭素和乙基香蘭素的色譜峰面積，測定結(jié)果列于表1。由表1可知，香蘭素與乙基香蘭素色譜峰面積測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.09%，0.89%，表明儀器的精密度良好。

表1 香蘭素與乙基香蘭素標準樣品色譜峰面積測定結(jié)果

2.5 線性關(guān)系、檢出限

分別精密吸取混合標準溶液 0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mL于10 mL容量瓶中，以流動相稀釋至標線，搖勻，制得不同濃度的混合標準溶液，分別精密吸取20 μL，按1.4色譜條件進樣測定色譜峰面積，以標準品濃度X(μg／mL)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，進行線性回歸，在0.5～10μg／mL的進樣范圍內(nèi)，香蘭素的線性方程為Y=6.656×10–6X+0.193，r2=0.9997；乙基香蘭素的線性方程為Y=8.022×10–6X+0.194，r2=0.9997，表明二者濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

將混合標準溶液以不同倍數(shù)稀釋后進行測定，以峰高為基線噪音3倍時的質(zhì)量濃度為檢出限，測得香蘭素和乙基香蘭素的檢出限分別為5.68 μg／L和12.8 μg／L。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一牛奶樣品6份，照上述樣品制備方法制備，按1.4色譜條件進樣測定香蘭素與乙基香蘭素的含量，測定結(jié)果見表2。由表2可知，牛奶樣品中香蘭素與乙基香蘭素平均含量為2.014 mg／kg和1.990 mg／kg，測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.35%，1.57%。表明方法測量重復性良好。

表2 牛奶樣品中香蘭素與乙基香蘭素含量測定結(jié)果

2.7 加標回收試驗

取牛奶樣品9份，每份為5 g，每3份為一組，每組分別加入混合標準溶液4，5，6 mL，按照1.3樣品溶液的配制方法進行提取和定容后，按1.4色譜條件測定，測定結(jié)果見表3。由表3可知，實驗所得香蘭素、乙基香蘭素平均加標回收率為99.8%，98.4%；測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.06%，2.31%。

表3 加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

牛奶樣品經(jīng)50℃熱水超聲提取并酸沉淀處理后，用HPLC法同時測定其中的香蘭素與乙基香蘭素，方法簡便，準確度高，重現(xiàn)性好，可以作為日常的檢測。

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