竹茶酒對D-半乳糖衰老模型小鼠抗衰老作用的研究

李昱鼎 葉小輝 葉乃興,* 林志達 鄭德勇 陳興煌

(1.福建農(nóng)林大學 茶葉科技與經(jīng)濟研究所，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學 食品科學學院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學 園藝學院，福建 福州 350002）

茶類酒是以茶葉為主要原料加工而成的新一代風味型酒，該酒酒度低，色澤鮮明透亮，入口軟棉，不刺喉，不上頭，同時富含功能成分[1]。竹酒是以竹葉或竹節(jié)為原料制成的一種竹香濃郁、純正，清香甘甜，具有藥用保健作用的特色酒[2]。兼具二者優(yōu)點的竹茶酒具有獨特而怡人的風味，而且含有較豐富的茶多酚、黃酮類化合物、氨基酸、茶多糖、蛋白質(zhì)等功能成分，具有良好的抗氧化抗衰老，降低膽固醇，降低心腦血管疾病的發(fā)病率，增強免疫功能等作用。本實驗觀測了竹茶酒對D-半乳糖所致亞急性衰老模型小鼠肝臟及血清中SOD、GSH-Px活性以及MDA含量等指標的影響，對竹茶酒的抗氧化抗衰老功能特性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 供試材料

ICR小鼠，由吳氏實驗動物中心提供；麻竹，由福建農(nóng)林大學提供；白茶、綠茶由福建謙謙一葉茶業(yè)科技有限公司提供；D-半乳糖、抗壞血酸、考馬斯亮藍G250、冰醋酸、無水乙醇，均由國藥集團化學試劑有限公司提供；丙二醛（MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）測試盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 主要儀器和設(shè)備

1.3 試驗方法

1.3.1 竹茶酒的制備

茶葉、竹子、水按照 3：7：100 的比例混合，置于錐形瓶中，沸水浴45min，每隔10min搖一次，過濾后冷卻備用。將洗凈的糯米加水浸泡120 min，瀝干后蒸15～20min，至飯粒內(nèi)無白芯，松軟透明。待蒸好的糯米冷卻后，按照酒曲、糯米、竹茶提取液1：50：100的比例混合均勻，加蓋后于28℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7d。將醪液在85℃下滅菌15min，過濾、冷卻后即得到竹茶酒。

1.3.2 動物實驗分組和設(shè)計

雄性ICR小鼠（清潔級）60只，置于標準鼠飼養(yǎng)籠里，每日光照12h，環(huán)境溫度25℃，每日添加飼料和水，并更換墊料。

實驗開始前，對小鼠進行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)并觀察以確認健康。將適應(yīng)環(huán)境后的小鼠隨機分成6組，每組10只，分別為：正常對照組、陽性對照組、衰老模型組、竹茶酒低劑量組、竹茶酒中劑量組、竹茶酒高劑量組。除正常對照組每日腹腔注射0.9%的生理鹽水外，其余各組小鼠每日腹腔注射D-半乳糖300mg/(kg·d)，持續(xù)6周。正常對照組、衰老模型組每日灌胃0.9%生理鹽水8mL/(kg·d)；竹茶酒低劑量組、中劑量組、高劑量組每日分別灌胃 4mL/(kg·d)、8mL/(kg·d)，16mL/(kg·d)竹茶酒；陽性對照組灌胃 10mg/(kg·d)維生素C溶液。連續(xù)灌胃6周后，摘眼球取血，將取血后的小鼠處死，解剖并摘取脾臟和肝臟。取出的脾臟和肝臟用0.9%的生理鹽水沖洗，洗凈表面殘留血液，用濾紙吸干后稱重。

1.3.3 血清、肝臟勻漿的制備

血清的制備：對小鼠摘眼球取得的血液，在3000r/min下離心15min得血清，4℃保存待用。

肝臟勻漿的制備：將用生理鹽水洗凈并用濾紙吸干的肝臟剪碎，精確稱重，放入玻璃勻漿器中，加入9倍體積的生理鹽水進行勻漿。

1.3.4 檢測指標

（1）小鼠血清、肝臟組織中丙二醛（MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的測定均按照試劑盒中的說明書進行操作。

（2）肝臟組織中的蛋白質(zhì)含量根據(jù)考馬斯亮藍法進行測定。

（3）臟器指數(shù)的計算公式：

1.3.5 統(tǒng)計分析

所測得結(jié)果均用平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)均采用SPSSV19.0完成統(tǒng)計處理，組間差異性采用t檢驗，以P<0.05為統(tǒng)計學顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹茶酒對小鼠臟器指數(shù)的影響

采用竹茶酒灌胃D-半乳糖衰老模型小鼠，6周后測定小鼠臟器指數(shù)，結(jié)果如表1所示。正常對照組與陽性對照組的肝臟指數(shù)存在顯著性差異（P<0.05），與衰老模型組、竹茶酒高中低劑量組之間無顯著差異；陽性對照組與衰老模型組、竹茶酒高中低劑量組之間無顯著差異。在脾臟指數(shù)中，竹茶酒低劑量組、中劑量組之間存在顯著差異，而竹茶酒低劑量組與正常對照組、衰老模型組、陽性對照組、竹茶酒高劑量組之間無顯著差異；竹茶酒中劑量組與正常對照組、衰老模型組、陽性對照組、竹茶酒高劑量組之間無顯著差異。

表1竹茶酒對小鼠臟器指數(shù)的影響

2.2 竹茶酒對小鼠肝臟組織中MDA含量及TSOD、GSH-Px活性的影響

采用竹茶酒灌胃D-半乳糖衰老模型小鼠，6周后測定小鼠肝臟組織中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性，結(jié)果如表2所示。與衰老模型組相比，各組均能顯著降低肝臟組織中的丙二醛含量（P<0.05），表明維生素C（陽性對照組）、高中低三個劑量的竹茶酒均能抑制MDA的產(chǎn)生。正常對照組與陽性對照組、竹茶酒中低劑量組之間無顯著差異。MDA的含量隨著竹茶酒灌胃劑量的增加而降低，其中高低劑量組之間的MDA含量差異達到顯著水平。與正常對照組相比，竹茶酒高劑量組MDA含量顯著降低，降低率達到35.4%。與衰老模型組相比，除了陽性對照組外，其他各組均能顯著提高肝臟中SOD的活性。正常對照組與竹茶酒低劑量組之間無顯著性差異，但竹茶酒高、中劑量組SOD活性與正常對照組相比顯著提高，提高率達15.9%、25.8%。對于GSH-Px活性的提高，與衰老模型組相比，其他各組均有顯著性的效果，表明維生素C、高中低劑量的竹茶酒均能顯著提高肝臟中GSH-Px的活性。正常對照組與陽性對照組以及高低劑量組之間無顯著差異，而竹茶酒中劑量組相較于正常對照組GSH-Px活性顯著提高，提高率為11.7%?？梢钥闯?，竹茶酒高中低劑量組均能顯著提高衰老模型小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px的活性，并顯著降低MDA的含量，而維生素C只能顯著降低MDA含量以及提高GSH-Px活性。

表2 小鼠肝臟組織中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性

2.3 竹茶酒對小鼠血清中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性的影響

采用竹茶酒灌胃D-半乳糖衰老模型小鼠，6周后測定小鼠血清中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性，結(jié)果如表3所示。與衰老模型組相比，除了竹茶酒低劑量組外，其他各組均能顯著性的降低血清中MDA的含量，陽性對照組與高中劑量的竹茶酒效果無顯著差異。與正常對照組相比，竹茶酒中劑量組MDA含量顯著降低，降低率達到19.4%。與衰老模型組相比，除了陽性對照組外，其他各組血清中SOD的活性均能顯著提高，表明高中低劑量的竹茶酒均對提高SOD活性有顯著效果。正常對照組與竹茶酒高中低劑量組無顯著性差異。隨著竹茶酒劑量的增加，SOD的活性不斷增加，但無統(tǒng)計學意義。而對于GSH-Px活性的提高，與衰老模型組相比，其他各組均有顯著效果。正常對照組與陽性對照組、竹茶酒低中劑量組之間無顯著差異，高劑量組較正常對照組GSH-Px活性顯著提高，提高率為9.7%。結(jié)果表明，高中低劑量的竹茶酒均能顯著提高衰老模型小鼠血清中SOD、GSH-Px的活性，維生素C只能提高GSH-Px活性；而高中劑量的竹茶酒和維生素C(陽性對照組)均能顯著降低MDA的含量。

表3 小鼠血清中MDA含量及T-SOD、GSH-Px活性

3 討論

機體代謝過程中會產(chǎn)生氧自由基（包括·O2-、·OH 、1O2、H2O2），生理正常情況下，能夠被體內(nèi)的抗氧化酶（如SOD、GSH-Px等）或抗氧化劑迅速清除，使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，一般不會對細胞產(chǎn)生損傷作用。隨著年齡的增長，機體內(nèi)抗氧化酶的活性會下降，使體內(nèi)清除自由基的能力下降，以至大量具有高度化學活性的氧自由基與機體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)等發(fā)生過氧化變性、交聯(lián)或斷裂等反應(yīng)[3-4]。當氧自由基與生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)時，生物膜的結(jié)構(gòu)和功能被破壞，從而引起細胞的衰老和死亡。脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物丙二醛（MDA）還可與蛋白質(zhì)、氨基酸等大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，交聯(lián)聚合物（脂褐素）不溶于水，會在腦、肝、腎、心肌、骨骼肌、腎上腺、皮膚等部位的細胞內(nèi)大量堆積，最終導致細胞代謝紊亂，從而加速機體的衰老進程[5]。

衰老模型的建立是評價抗衰老藥物以及研究抗衰老機制的關(guān)鍵。衰老動物模型主要有D-半乳糖所致衰老模型、SAMP小鼠衰老模型、臭氧損傷衰老模型、去胸腺衰老模型、自然衰老模型等[6]。其中D-半乳糖所致亞急性衰老模型因為其操作簡便、成本低廉、結(jié)果穩(wěn)定等特點，被大量學者運用。在一段時間內(nèi)，連續(xù)對動物進行皮下注射或腹腔注射大量的D-半乳糖，而D-半乳糖在還原酶作用下生成的半乳糖醇不能被細胞代謝，而沉積在細胞內(nèi)，會增大細胞滲透壓，破壞細胞的正常代謝，最終導致衰老的發(fā)生[7-8]。

本試驗連續(xù)42d對小鼠腹腔注射300mg/(kg·d)的D-半乳糖，由實驗結(jié)果可知，衰老模型組的小鼠血清及肝臟中SOD、GSH-Px的活性明顯高于正常對照組，而MDA的含量明顯低于正常對照組，說明本實驗建模成功。本研究結(jié)果表明，竹茶酒能降低衰老小鼠肝臟、血清中MDA的含量，提高SOD、GSH-Px的活性，說明竹茶酒可提高自由基的清除率，減少自由基對機體產(chǎn)生的損傷，具有抗衰老作用。

［1］鄔齡盛，葉乃興，王振康.淺析茶類酒生產(chǎn)的現(xiàn)狀及展望[J].茶葉科學技術(shù)，2005（1）：27-28.

［2］孫世中，高旭紅，劉劍虹，等.版納甜龍竹發(fā)酵酒的制作[J].云南師范大學學報，2008，28（1）：34-36.

［3］劉斌，齊云，李蒙，等.分光光度法與熒光法測定肝組織丙二醛含量的比較研究［J］.中國藥理學通報，2010，26（12）：1674-1677.

［4］ Serranoa F,Klann E.Reactive oxygen species and synaptic plasticity in the aging hippocampus ［J］.Ageing Res Rev,2004,3(4)：431-433.

［5］凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2004.

［6］秦紅兵，楊朝曄，范憶江，等.D-半乳糖誘導衰老小鼠模型的建立與評價［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（7）：1275-1278.

［7］石根勇，呂中明，陳新霞，等.建立衰老模型的實驗研究［J］.江蘇預(yù)防醫(yī)學，2003，14（2）：63-64.

［8］許揚，吳濤，顧佳黎，等.D-半乳糖誘導衰老動物模型研究進展［J］.中國老年學雜志，2009（29）：1710-1712.