尋常性銀屑病患者外周血和皮損中Thl7細胞表達及相關(guān)性研究

鄧俊峰羅志廣黃俊青楊國良

1.深圳寶安石巖人民醫(yī)院，廣東深圳518108;2.深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院，廣東深圳518108

尋常性銀屑病俗稱牛皮癬，是一種常見的具有特征性皮損的慢性易于復(fù)發(fā)的皮膚病。該病頑固難治，是當(dāng)今世界皮膚科領(lǐng)域的重要研究課題，是全世界皮膚科重點防治疾病之一。目前Th17細胞在銀屑病發(fā)病過程中的作用越來越引起人們的重視，研究認為Th17細胞及相關(guān)因子IL-17、IL-22表達與尋常性銀屑病患者疾病嚴重程度相關(guān)[1]。該研究旨在探討尋常性銀屑病患者外周血和皮損中Th17細胞及相關(guān)因子IL-17、IL-22表達，選取2012年1月—2012年12月該院收治的127例銀屑病患者分成兩組，門診就醫(yī)確診的銀屑病患者78例為實驗組，另選取門診和住院外科手術(shù)患者48例無銀屑病等免疫相關(guān)性疾病為對照組，分析其與疾病嚴重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗組：參照1991年10月中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病學(xué)會頒布的尋常性銀屑病診斷標(biāo)準，遴選病例。對照組：所選病例近1個月未作局部治療，2個月內(nèi)未作任何免疫抑制劑治療，無其他免疫性皮膚病及系統(tǒng)性疾病，觀察前1個月內(nèi)無細菌、真菌、病毒感染，既往無銀屑病等免疫相關(guān)皮膚疾病。

1.2 研究對象

選取該門診就醫(yī)確診的銀屑病患者78例為實驗組，男49例，女29例，年齡24～65歲，平均43歲，病程4個月～22年，平均8.5年，PASI[2]評分22～60.6分。另外選取門診和住院外科手術(shù)患者48例(無銀屑病等免疫相關(guān)性疾病)為對照組，男29例，女19例，年齡25～63歲，平均44歲。

1.3 主要試劑

兔抗CD4、兔抗IL-17（北京中杉金橋公司），量子點雙染熒光試劑盒（武漢珈源量子點技術(shù)有限公司）,流式抗體藻紅蛋白一青色素染料5(PE-cy5)抗人CD3，F(xiàn)ITC抗人CD8，藻紅蛋白(PE)抗人 IL一 17A，PE鼠IgG同型對照（美國 eBioscience公司）,佛波酯肉豆蔻酸乙酸鹽(PMA)、莫能星鈉鹽、伊屋諾霉素鈣鹽購自美國 Sigma公司，F(xiàn)IX&PERM（聯(lián)科生物科技有限公司），IL-17、IL-22ELISA試劑盒（聯(lián)科生物科技有限公司），多光譜成像儀（Nuance美國劍橋儀器公司），F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀 （美國BD公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 組織中Th17細胞的表達 收集實驗組患者典型皮損組織和對照組正常皮膚組織。所取組織常規(guī)石蠟包埋，切片厚度3 μm，切片脫蠟水化，微波抗原修復(fù)，滴加稀釋的CD4一抗，37℃濕盒孵育 2 h。加吐溫 20的 Tris緩沖鹽水(TBs-T)洗滌(3×5 min)，滴加緩沖液，37℃濕盒孵育封閉10 min；滴加稀釋的生物素化IgG，37℃濕盒孵育30 min；緩沖液封閉20 min；滴加稀釋的量子點標(biāo)記的鏈酶親和素復(fù)合物 (QDs-SA)，37℃濕盒孵育30 min；TBS-T洗滌(3×5 min)，滴加緩沖液。37℃濕盒孵育封閉10 min；滴加稀釋的IL-17一抗，4℃過夜。TBS-T洗滌(3×5 min)，滴加緩沖液，37℃濕盒孵育封閉20 min；滴加稀釋的量子點標(biāo)記的免疫球蛋白 G 復(fù)合(QDs-IgG)，37℃濕盒孵育 30 min；TBS-T 洗滌(3×5 min)，Tris緩沖鹽水(TBS)洗滌(2×5 min)。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)觀察成像,多光譜分析儀分析結(jié)果存盤。QDs-SA波長605 nm，發(fā)紅光，QDs-IgG波長525 nm，發(fā)綠光。紅色信號為CD4，綠色信號為IL-17+，黃色區(qū)域CD4+IL-17+即為Th17細胞。

1.4.2 Th17細胞流式細胞儀計數(shù) 采集實驗組和對照組靜脈血2 mL，肝素鈉抗凝，24 h內(nèi)檢測。取1只試管加入150 μL血液和150 μL RPMI1640細胞培養(yǎng)基，加入LPMA工作液、伊屋諾霉素工作液和莫能星工作液，混勻，37℃、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，進行破膜和胞內(nèi)細胞因子染色，用流式細胞儀測定細胞熒光抗體染色陽性率，即CD4+CD8-IL-17+細胞群所占的百分比。

1.4.3 血清中IL-17、IL-22的檢測 采集銀屑病患者和正常人對照者靜脈血3 mL，靜置留取血清500 μL，置于-20℃保存待檢。按照ELISA檢測試劑盒說明進行，酶標(biāo)儀讀取A值。

1.5 統(tǒng)計方法

使用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，檢測結(jié)果以（±s）表示，采用χ2檢驗、Wilcoxon秩和檢驗和Spearman相關(guān)分析等統(tǒng)計學(xué)方法。

2 結(jié)果

2.1 組織中Th17細胞表達比例

實驗組患者組織中Th17細胞表達比例為(3.1±1.0)%，對照組為(0.4±0.2)%,兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 尋常型銀屑病患者Th17細胞中的CD4及IL-17抗體表達陽性率比較

實驗組患者CD4及IL-17抗體陽性表達率為(2.9±1.1)%，對照組為(0.5±0.4)%,兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。銀屑病患者Th17細胞中的CD4及IL-17抗體表達陽性率與PASI無相關(guān)性(r=0.321,P>0.05)。

2.3 銀屑病患者外周血中IL-17和IL-23水平比較

實驗組患者外周血IL-17和IL-23表達水平明顯高于對照組(P＜0.05)，并與 PASI呈正相關(guān)(r=0.501,P<0.05)，見表 1。

表1 銀屑病患者外周血中IL-17和IL-23水平比較

3 討論

銀屑病是皮膚科最為常見的一種慢性的具有特征性皮損的炎癥性皮膚病，皮損可僅僅發(fā)生在身體的某一個部位，也可以遍布全身各處。表現(xiàn)為紅色的丘疹、紅斑或大小不等的扁平斑塊[2-3]。上面覆蓋著厚薄不等、容易脫落的銀白色鱗屑。把鱗屑刮掛去后，可見到一層光滑的紅色薄膜，再把薄膜揭去，即可見到一些細如針尖的出血點。這種紅色薄膜和點狀出血的現(xiàn)象，是尋常型銀屑病的重要特征[4]。且銀屑病還具有復(fù)發(fā)性和持續(xù)性，這對患者的身心健康和生活質(zhì)量造成了嚴重的影響，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所對皮膚病作了大量研究，結(jié)果表明銀屑病在皮膚科門診總量中占有較大的比例[5-6]，且患病人數(shù)逐年增加，但目前尚沒有能根治銀屑病有效治療手段，所以新的治療方法和治療藥物急需解決。

研究證明,在銀屑病的發(fā)生發(fā)展全過程中免疫細胞和炎癥因子起到了重要作用[3]，該研究發(fā)現(xiàn)尋常性銀屑病患者外周血和皮損中Thl7細胞及相關(guān)因子IL-17、IL--22表達與疾病嚴重程度呈正相關(guān)，提示銀屑病患者外周血IL-17和IL-23高表達,可能是銀屑病免疫發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。因此該研究認為可以通過對IL-23/Th17細胞通路進行干預(yù)，而找到診斷和治療尋常性銀屑病的新途徑和新藥物。這將對治療尋常性銀屑病有很大幫助。

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[2] 張長宋，趙天恩，陳樹民.銀屑病病情嚴重程度評判指標(biāo)的研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)學(xué)（皮膚性病學(xué)分冊），2002，28(2)：82，84.

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[5] 韓鳳嫻,徐麗敏,趙宏麗,等.流式細胞分析法測定外周血皮膚淋巴細胞相關(guān)抗原陽性T細胞在尋常性銀屑病中的表達[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2008，7（3）：158-159.

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