阿托伐他汀對Aβ1－40誘導AD模型的氧化應激及凋亡的影響

馬興榮 孫治坤 劉艷茹 賈延劼 張博愛△

1）鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科 鄭州 450052 2）河南省人民醫(yī)院神經內科 鄭州 450003

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是以進行性認知功能障礙和記憶力減退為主要臨床表現的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，Aβ樣淀粉蛋白沉積是其重要的病理學特征。越來越多的證據表明Aβ樣淀粉蛋白沉積引起的氧化應激和細胞凋亡是AD的重要發(fā)病機制［1－2］。大量的臨床研究表明，他汀類藥物可以明顯降低AD的發(fā)病率，減緩AD的進展，其機制尚未完全清楚［3］。本研究我們通過阿托伐他汀干預大鼠AD模型，觀察其對腦組織內丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽（GSH）活性的影響，及Bcl－12和Caspase－3蛋白表達的影響，來探討阿托伐他汀對AD的神經保護作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 雄性SD大鼠40只，體質量250～300g（河南省實驗動物中心），隨機分為空白對照組、假手術組、β淀粉樣蛋白（Aβ）組、Aβ＋生理鹽水組、Aβ＋阿托伐他汀組，每組8只。

1．2 動物模型的制作及分組 參照我們自己的制作模型方法［4］，用無菌生理鹽水將 Aβ1－40（由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院多肽室提供）稀釋為10g／L，37℃孵育1周，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ。Aβ組、Aβ＋生理鹽水、Aβ＋阿托伐他汀組：大鼠以體積分數為10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0．4g／kg）后，固定于腦立體定向儀上（由鄭州大學人體解剖學教研室提供），選擇雙側海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，于前囟向后3．0mm、中線旁開2．0mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自腦表面垂直進針2．8mm，將Aβ溶液1μL緩慢注入，留針5min，以保證溶液充分彌散，緩慢撤針，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。假手術組注入等體積生理鹽水。空白對照組不做任何處理。Aβ＋阿托伐他汀組給予阿托伐他汀20mg／（kg·d）灌胃，術前1周至術后4周，1次／d，共5周。Aβ＋生理鹽水組，與相同的時間點給予等量生理鹽水灌胃，方法同上，共5周，其余各組不做治療干預。

1．3 大鼠皮層、海馬組織 MDA、SOD及GSH活性檢測各組大鼠在行為學檢測結束后，隨機取各組4只大鼠行MDA、SOD及GSH活性檢測，將大鼠斷頭取腦，在冰盒上剝離皮層與海馬組織并稱質量，按照重量和體積比1：10的比例，加入預冷的0．9%生理鹽水冰浴勻漿，4℃離心（3 000r／min，10min），取上清液，立即測定。（1）MDA 活性測定：過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產物，在540nm處有最大吸收峰。MDA活性以nmol·mg－1Pro表示。（2）SOD活性測定：采用黃嘌呤氧化法，SOD活性以每毫克組織蛋白中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個亞硝酸鹽單位（U·mg－1Pro）表示。（3）GSH活性檢測：二硫代二硝基甲酸與巰基化合物反應時能產生一種黃色化合物，在405nm測吸光度值。GSH活性以nmol·mg－1Pro表示。具體操作按試劑盒說明進行。

1．4 蛋白印跡技術檢測大鼠海馬區(qū)Bcl－2及Caspase－3的表達 各組大鼠在行為學檢測結束后，各組剩余4只大鼠行蛋白印跡技術檢測大鼠海馬區(qū)Bcl－2及Caspase－3的表達，各組大鼠斷頭處死后迅速取出大腦組織，用預冷的PBS液沖去表面血跡，置冰盤上快速分離出雙側海馬組織，加入蛋白裂解液，冰上裂解、勻漿，5 000r／min離心15min，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。經10%SDS－PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉后，加入一抗孵育過夜。加入標記辣根過氧化酶的二抗，室溫下孵育1h，ECL顯示。β－actin為內參照，實驗在相同的條件下重復3次。

1．5 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS 16．0進行數據處理。數據用（±s）表示，對結果進行方差齊性檢驗，符合條件后進行后續(xù)分析，多組數值間比較采用單因素方差分析，方差分析后多個樣本間比較用LSD法。取α＝0．05作為檢驗水準。

表1 阿托伐他汀對AD大鼠模型皮層、海馬MDA、SOD及GSH活性的影響

2 結果

2．1 阿托伐他汀對AD大鼠模型皮層、海馬的 MDA、SOD及GSH活性的影響 與空白對照組相比，Aβ組大鼠腦皮質、海馬組織內 MDA的活性明顯升高（P＜0．05）、SOD及GSH的活性明顯降低（P＜0．05）；與 Aβ組相比，Aβ＋阿托伐他汀治療治療組大鼠腦皮質、海馬組織內MDA的活性明顯降低（P＜0．05）、SOD及 GSH 的活性明顯升高（P＜0．05）。

2．2 阿托伐他汀對 AD大鼠模型海馬組織Bcl－2及Caspase－3表達的影響 Aβ組與空白對照組相比Bcl－2表達明顯下降（P＜0．05），Caspase－3表達明顯升高（P＜0．05）；Aβ＋阿托伐他汀治療組與Aβ組相比Bcl－2表達上升（P＜0．05），Caspase－3表達下降（P＜0．05）。

3 討論

AD是癡呆中最常見的一種類型，隨著人類社會的老齡化進展，發(fā)病率在不斷升高，對于其防治的研究也成為目前研究的熱點。他汀類藥物作為一種調脂藥物，目前在臨床上廣泛用于降低膽固醇水平和改善冠脈疾病患者的預后。近期他汀類藥物降脂作用以外的藥理作用，受到越來越多的關注，如其抗炎癥和抗氧化的作用。近期大量的研究結果顯示，他汀類藥物可以降低AD的發(fā)病率，改善AD患者的認知功能和延緩AD的病程進展［5－6］。但目前他汀類藥物對于AD的保護作用機制仍不十分明確，總結近幾年的試驗顯示，他汀類藥物對AD的保護作用機制可能與以下幾方面有關［7］：（1）減少β淀粉樣蛋白的產生；（2）降低血漿中膽固醇和24S膽固醇的含量，保護神經細胞；（3）減少載脂蛋白E（ApoE），阻止老年斑塊的形成；（4）抗炎作用；（5）改善血液供應；（6）阻斷異戊二烯化過程。

諸多實驗研究表明腦組織的氧化應激反應參與了AD的發(fā)生和發(fā)展［8］，且氧化應激是AD的主要致病因素，而且在一定程度上氧化應激假說可以綜合其他幾種假說。MDA、SOD和GSH是與機體氧化還原狀態(tài)密切相關的物質，直接反映機體的氧化還原狀態(tài)。MDA是氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過氧化反應的代謝產物，MDA的含量可以反映體內脂質過氧化的程度并間接反映引起脂質過氧化的氧自由基水平。因此組織內MDA含量可以反映組織中氧自由基水平和脂質過氧化反應的強弱［9］。SOD是生物體最主要的自由基清除酶，可催化O2發(fā)生歧化反應，通過歧化反應清除體內生成的氧自由基，阻斷自由基病理性連鎖反應，對保護細胞不受氧自由基損傷有重要作用，通過測定SOD活性可以反映組織清除自由基的能力。GSH在體內廣泛存在，特異性催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結構和功能的作用［10－11］。因此，我們對MDA、SOD及GSH的活性進行了檢測，結果發(fā)現，Aβ組與空白對照組相比，MDA的活性明顯升高，SOD及GSH的活性明顯降低（P＜0．05）；同時，我們還發(fā)現，Aβ＋阿托伐他汀治療組 MDA活性較 Aβ組明顯降低（P＜0．05）；SOD及GSH活性較Aβ組明顯升高（P＜0．05）。我們的結果表明，阿托伐他汀可以明顯提高AD大鼠模型腦組織中SOD及GSH的活性，降低MDA的活性，在清除自由基、減輕自由基對機體的損害方面具有一定的作用。

凋亡是AD發(fā)病機制中一重要機制，其存在2種主要的相互關聯途徑：細胞表面死亡受體途徑（外源性途徑）和線粒體途徑（內源性途徑），Caspase－3和Bcl－2在細胞凋亡中起重要作用。正常狀態(tài)下，無活性的Caspase－3以酶原形式存在于腦細胞中，可經以上2條途徑被激活?；罨腃aspase－3可以切割許多蛋白質底物，包括細胞骨架蛋白，參與調節(jié)細胞骨架的蛋白、參與DNA修復的酶及抗凋亡蛋白Bcl－2等，最終引起細胞死亡，完成其“瀑布式”級聯反應［12］。Bcl－2是Bcl－2家族中重要的抗細胞凋亡基因，主要在細胞凋亡內源性途徑中發(fā)揮作用。它可通過阻斷細胞色素C的釋放，抑制下游Caspase－3的激活，從而抑制凋亡的發(fā)生；同時，Bcl－2又是Caspase－3的作用底物，可被 Caspase－3水解［13］。在我們的研究中發(fā)現與空白對照組相比Aβ組腦組織中Bcl－2的表達下降（P＜0．05），Caspase－3的表達上調（P＜0．05），Aβ＋阿托伐他汀治療組與 Aβ組相比Bcl－2的表達上調（P＜0．05），Caspase－3的表達下降（P＜0．05）。研究結果表明阿托伐他汀可以調控Bcl－2及Caspase－3的表達，從而起到抗凋亡的作用。

通過以上的研究結果顯示，阿托伐他汀對AD大鼠模型有一定的神經保護作用，具體作用機制可能與抑制氧化應激和抑制細胞凋亡相關。

［1］Crews L，Masliah E．Molecular mechanisms of neurodegeneration in Alzheimer＇s disease［J］．Hum Mol Genet，2010，19（R1）：R12－20．

［2］卓燁燁，張漢霆，徐江平，等 ．氧化應激與阿爾茨海默病［J］．中國藥理學通報，2010，26（4）：435－437．

［3］Sparks DL，Sabbagh MN，Connor DJ，et a1．Atorvastatin for the treatment 0fmild to moderate AIzlleimer disease：preliminary results［J］．Arch Neural，2005，62（5）：753－757．

［4］張博愛，馬興榮，賈延劼，等 ．尼美舒利對Alzheimer大鼠的腦保護作用［J］．鄭州大學學報（醫(yī)學版），2006，41（3）：483－486．

［5］Scow D，Cauthier S．Pharmaeotherapy of Alzheimer，s disease［J］．Can J Psychiatry，2007，52（10）：620－629．

［6］Haag MD，Hofman A，Koudstaal PJ，et al．Statins are associated with a reduced risk of Alzheimer disease regardless of lipophilicity．The Rotterdam Study［J］．J Neurosrg Psychiatry，2009，80（1）：13－17

［7］Ostrowski SM，Wilkinson BL，Golde TE，et al．Statins reduce amyloid－βproduction through inhibition of protein isoprenylation［J］．J Biol Chem，2007，282（37）：26 832－26 844．

［8］Gackowski D，Rozalski R，Siomek A，et a1．OX’ldative stress and oxidative DNA damage is characteristic for mixed Alzheimer disease／vascular dementia［J］．J Neurol Sci，2008，266（1－2）：57．

［9］Del Rio D，Stewart AJ，Pellegrini N．A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress［J］．Nutr Metab Cardiovasc Dis，2005，15（4）：316－328．

［10］Zou X，Feng Z，Li Y，et al．Stimulation of GSH synthesis to prevent oxidative stress－induced apoptosis by hydroxytyrosol in human retinal pigment epithelial cells：activation of Nrf2 and JNK－p62／SQSTM1pathways［J］．J Nutr Biochem，2012，23（8）：994－1 006．

［11］Paamoni－Keren O，Silberstein T，Burg A，et al．Oxidative stress as determined by glutathione（GSH）concentrations in venous cord blood in elective cesarean delivery versus uncomplicated vaginal delivery［J］．Arch Gynecol Obstet，2007，276（1）：43－46．

［12］王旭剛，高政 ．預防性應用阿托伐他汀對SD大鼠局部腦缺血再灌注腦組織Caspase－3表達的影響［J］．中國實用神經疾病雜志，2011，14（16）：20－22．

［13］Zheng－Yuan Su，Yen－Chen Tung．Blazeispirol A from Agaricus blazei Fermentation Product Induces Cell Death in Human Hepatoma Hep 3BCells through Caspase－Dependent and Caspase－lndependent Pathways［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（9）：5 109－5 116．