遺傳性疾病PMD的Dys基因多態(tài)性探討

王銀龍 沈艷峰 王友明 魏東敏 潘秀蘭 閆紀琳 單鐵英 耿建芳

河北工程大學附屬醫(yī)院 邯鄲 056002

本課題應用聚合酶鏈式反應－序列特異性引物（PCR－SSP）方法對56例Duchenne型（DMD）及59例Becker型（BMD）兩類患者的臨床特點及其與Dys基因多態(tài)性的相關性進行分析，旨在探討兩類亞型病癥的易患因素及防治手段。

1 材料與方法

1．1 臨床資料 BMD與DMD患者為1988—2007年我科收集的病例，患者籍貫為長江流域，均為漢族。在有近親關系的家族中有3例及以上則判定符合診斷標準，在此標準下，BMD患者病例入選59例（17個家系），均為男性。發(fā)病年齡13．0～29．0歲，對該組患者臨床表征進行數(shù)年追蹤研究，具體內容有發(fā)病年齡、伴發(fā)疾病、臨床類型及疾病轉歸和治療反應性等；DMD患者病例入選56例，均為男性，發(fā)病年齡2～5歲無其他自身免疫性疾病或家族史。診斷標準：（1）病態(tài)的疲勞程度。（2）肌電圖及胸腺CT檢查。（3）臨床癥狀的波動性。健康對照組（NC）與2組患者的籍貫相同，均為漢族，無自身免疫性疾病及家族史，共40名。

1．2 實驗方法 基因組DNA提取按照提取試劑盒（Promega，美國）的步驟進行。按照參考文獻［1］合成Dys1序列特異性引物，通過PCR－SSP方法對Dys進行基因分型，反應體系25μL，利用Toyobo公司Taq酶及緩沖體系，其中DNA含量保持在80～100ng，內參引物2．5μmoL／L，引物3 μmoL／L，Tag酶1U。PCR產物經過1．5%的瓊脂糖凝膠電泳，然后再紫外燈下對結果進行拍照。

1．3 統(tǒng)計學分析 組間和組內的發(fā)病年齡比較利用t檢驗，性別和病癥亞型構成比采用χ2檢驗。通過Hardy－Weinberg吻合度測驗對估計資料進行可靠性分析。計算各組Dys各等位基因頻率，組間基因頻率比較采用Fisher檢驗，當P＜0．05，計算相對危險度RR。

2 結果

2．1 遺傳性BMD與DMD患者臨床資料對比 DMD型患者的臨床癥狀具有較大差異，由于患者依靠輪椅，而造成該病癥出現(xiàn)了三種臨床亞型［1］?；颊咴?～5歲就表現(xiàn)出肌無力，于10歲左右需要輪椅，在20歲左右就有高死亡概率。而BMD型患者于13歲左右才會出現(xiàn)肌無力癥狀，在16歲以后才會借助輪椅，一般壽命在50歲左右，甚至有患者的壽命超過60歲。見表1。

表1 遺傳性BMD與DMD患者臨床資料對比 （±s，歲）

表1 遺傳性BMD與DMD患者臨床資料對比 （±s，歲）

注：2組比較，＊P＜0．01

類型 n 發(fā)病年齡 輪椅輔助年齡 死亡年齡DMD 56 3．61±1．78＊ 10．32±1．32＊20．54±1．89 BMD 59 13．24±1．42 16．23±1．36 50．23±1．65＊

2．2 短串聯(lián)重復序列（STR）位點的多態(tài)性 5個短串聯(lián)重復序列（STR）的位點均包含CA二核苷酸的重復序列，表2結果顯示各位點的片段長度多態(tài)性。此表中STR－49共檢測到6個多態(tài)性片段，長度225～260bp，最具多態(tài)性。其次5’DMDⅡ和Intron 45都具有5個多態(tài)性片段，長度152～226。Intron 44和Intron 50均具有4個多態(tài)性片段，長度178～244。根據(jù)此表，通過STR多態(tài)性連鎖分析法能夠作為非缺失型DMD／BMD患者和攜帶者的診斷方法。見表2。

2．3 BMD／DMD患者外顯子缺失突變分析 由表3結果顯示，DMD型患者16例在1～36位外顯子，36例分布在37～57位外顯子，僅4例分布在58～76位外顯子。BMD型患者17例在1～36位外顯子，39例分布在37～57位外顯子，僅3例在58～76位外顯子。見表3。

表3 5個STR位點的片段大小多態(tài)性

3 討論

進行性肌營養(yǎng)不良是進行性骨骼肌無力和萎縮為特征的一類遺傳性疾病，發(fā)病機制具有復雜性，臨床表現(xiàn)多樣，但共同導致相關肌群的不同程度的肌肉萎縮特征［2］。以肌肉萎縮的發(fā)生部位，肌營養(yǎng)不良癥可分為6種亞型，分別是Duchenne／Becker型（DMD／BMD）、Emery－Dreifuss型（EMDM）、面－肩－肱型（FSHD）、遠端型（Distal Muscular Dystrophy）、肢－帶型（LG－MD）、眼咽肌型（OPMD）。而臨床上多見于Duchenne／Becker型，其中DMD是臨床上發(fā)生率最高的X連鎖隱性遺傳，其患者多在學齡前期出現(xiàn)進行性肌肉無力［3］。據(jù)相關統(tǒng)計顯示，DMD在新生男嬰的發(fā)病率為1／3 500，而BMD為1／30 000［4］。近來有研究表明，85%的BMD和65%的DMD患者均有抗肌萎縮基因的缺失。本課題通過分析抗肌萎縮基因缺失外顯子的分布位置，初步得出了高缺失概率的外顯子位置，為進行缺失突變型BMD／DMD病癥的診斷提供了一定的理論基礎。

然而，非缺失突變也是進行性肌營養(yǎng)不良的另一原因，約40%的BMD／DMD患者屬于抗肌萎縮基因非缺失突變類型，然而針對此類型病癥的診斷則成為了當前的一大臨床診斷難題［5］，而由于STR位點位于dystrophin基因的啟動子與內含子中，這些位點具有重復次數(shù)多、雜合率較高以及高度多態(tài)性的特點，同時這些位點分布于缺失熱點區(qū)域，所以適合于基因連鎖分析，因此通過STR多態(tài)性連鎖分析法理論上具備了作為診斷非缺失突變類型的可行性，更重要的是，STR多態(tài)性連鎖診斷能夠進行產前基因診斷，進行對BMD／DMD基因攜帶者的診斷，以預防BMD／DMD遺傳疾病。早期診斷對進行性肌營養(yǎng)不良癥具有重要的意義，雖然該病癥與地域差別無關，但與經濟發(fā)展水平，社會的文明程度，健康教育水平等狀況有密切的關系。一旦大眾認識到該病與遺傳具有緊密的關系，就會主動與醫(yī)生合作，加強胎孕檢查，預防下一胎攜帶疾病基因或患病的胎兒出生［6］。另外，還有必要進行擴大范圍的篩查本病的基因攜帶者，如患兒母親的姐妹，表姐妹及其他有血緣關系的母系女性，這些親屬在生育時，均應該進行相關的遺傳病癥的篩查檢測，以防止相關疾病基因的擴散。

隨著分子生物學的深入研究，進行性肌營養(yǎng)不良癥從不同類型和亞型的分子機制進行了細致的研究，這一工作的重要性在于為該病癥的基因攜帶者檢出，產前診斷，類型區(qū)別及明確診斷提供了可行性。伴隨人類基因組的草圖制圖完成，當前已進入基因后時代，進行性肌營養(yǎng)不良的發(fā)病機制，該疾病的基因和編碼蛋白的分離，以及功能蛋白的研究均將得到進一步的提高。

［1］曹玉紅，張光運，張國成，等．Duchenne型進行性肌營養(yǎng)不良40例臨床分析 ［J］．臨床床兒科雜志，2008，26（2）：96－98．

［2］黃憲章，李艷 ．雌激素受體基因多態(tài)性的研究進展［J］．國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2000，21：254－255．

［3］Parreira SL，Resende MB，Della C，et al．Quantification of muscle strength and motor ability in patients with duchenne muscular dystrophy on steroid therapy［J］．Ara Neuropsiquiatr，2007，65（2A）：245－250．

［4］Shimomura H，F(xiàn)ujii T，Miyajima T，et al．Prednisolone treatment for Duchenne muscular dystrophy［J］．No To Hattatsu，2011，43（1）：24－29．

［5］謝琰臣，矯毓娟，許賢豪，等．重癥肌無力患者外周血單個核細胞中糖皮質激素受體不同亞型表達和意義［J］．中華內科雜志，2007，46：56－59．

［6］Corvol H，Nathan N，Charlier C，et al．Glucocorticoid rcoeptor gene polymorphisms associated with progression of lung disease in young patients with cystic fibrosis［J］．Respir Res，2007，8：88－96．