高效液相色譜法檢測(cè)雞蛋中三聚氰胺殘留量的探討

陳 玲 魏秀麗 尹伶靈 張呈軍 張 穎

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 濟(jì)南 250022）

近幾年來發(fā)生的三聚氰胺奶粉、飼料、雞蛋等事件的曝光，嚴(yán)重影響了畜產(chǎn)品安全[1]。三聚氰胺(化學(xué)式：C3H6N6)，俗稱蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被廣泛用作化工原料。但因三聚氰胺含氮量高，被不法分子添加于奶粉和飼料中增加蛋白質(zhì)含量。三聚氰胺奶粉、雞蛋事件引起了廣泛的關(guān)注。隨后國(guó)家及科研機(jī)構(gòu)發(fā)布了原料乳、飼料中三聚氰胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，有液相色譜法、氣質(zhì)、液質(zhì)等方法[1-5]，但雞蛋中三聚氰胺的檢測(cè)方法極少。為了保障雞蛋食品的安全，本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了雞蛋中三聚氰胺殘留量的檢測(cè)-高效液相色譜法。試樣經(jīng)勻質(zhì)、用三氯乙酸提取、固相萃取柱凈化，通過優(yōu)化色譜條件，采用反反向色譜柱，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量,線性良好，回收率高，滿足檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器。分析天平：感量0.00001g。離心機(jī)：8000r/min。組織勻漿機(jī)。振蕩器。氮吹儀。

1.2 藥品及試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（C3H6N6）：德國(guó)DR.公司C14861400，批號(hào)81114，含量99.00%。甲醇、乙腈：色譜純。三氯乙酸、醋酸鉛、氨水、醋酸銨、鹽酸均為分析純。超純水。MCX弱陽(yáng)離子交換萃取柱。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：XBridgeTM Hilic 5μm，4.6×150mm；流動(dòng)相：10mmol醋酸銨水溶液：乙腈(v/v,5/95)溶液；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：230nm，流速：1.0ml/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量為20μl。

1.3.2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0mg/ml)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(精確至0.1mg)，用甲醇溶液(50%)溶解后并定容至50ml容量瓶中，混勻，4℃條件下保存，有效期為3個(gè)月。準(zhǔn)確取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測(cè)定。以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品制備 提取：雞蛋樣品勻漿，準(zhǔn)確稱取試樣適量2.00+0.05g于50ml試管中，準(zhǔn)確加入9ml濃度為1%的三氯乙酸溶液，然后加入1ml飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白，旋渦1min，搖床震蕩提取15min，8000r/min離心10min，取上清液備用。凈化：分別用3ml甲醇，5ml水活化mcx固相萃取小柱，取5ml提取液過柱后，用0.1mol的鹽酸和甲醇洗滌小柱，擠干后用3ml濃度為5%的氨水甲醇洗滌溶液洗脫，收集洗脫液用氮?dú)獯蹈?，最后?ml流動(dòng)相溶解，用0.22um的濾膜過濾后，用HPLC測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在選定的色譜條件下，可以有效的分離三聚氰胺，在0.5-50μg/ml范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.33×104x+1.08×103(R2=0.9999)，線性良好。

2.2 方法的靈敏度

雞蛋的空白試料按上述的步驟處理后，測(cè)定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白試料對(duì)所測(cè)分析物無干擾?？瞻讏D譜見圖1，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖2，三聚氰胺陽(yáng)性添加圖譜見圖3。

圖1 空白雞蛋色譜圖

圖2 三聚氰胺(1ug/ml)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖3 三聚氰胺(2.5mg/kg)陽(yáng)性添加色譜圖

在空白雞蛋中添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制成0.5、1、2.5、5mg/kg三個(gè)濃度的空白添加樣品，按確定的提取凈化方法處理后，經(jīng)高效液相檢測(cè)，計(jì)算信噪比。添加濃度為0.5mg/kg時(shí)，三聚氰胺峰信噪比(S/N)>3，確定為方法的檢測(cè)限，添加濃度為1mg/kg時(shí)，三聚氰胺峰峰面積響應(yīng)值和信噪比滿足最低定量限的要求信噪比(S/N)>10，確定為方法的最低定量限。

2.3 方法的精密度和準(zhǔn)確度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在雞蛋空白勻漿組織中添加3個(gè)不同濃度的三聚氰胺進(jìn)行回收率試驗(yàn)。三聚氰胺分離良好，無任何干擾物，陽(yáng)性添加回收率均在70%～100%范圍內(nèi)。雞蛋中的添加濃度分別為0.5mg/kg(檢測(cè)限)、1mg/kg(定量限)、2.5mg/kg(MRL)、5mg/kg(2MRL)。各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，具體結(jié)果見表1。

表1 雞蛋中三聚氰胺的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (%)

2.4 反反相色譜柱、色譜柱壽命長(zhǎng)、色譜峰峰形

GB/T22388-2008原料乳及乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)方法-HPLC中檢測(cè)三聚氰胺[2]采用的是反相色譜柱，流動(dòng)相采用的是離子對(duì)試劑緩沖溶液乙腈。由于流動(dòng)相中含有大量的離子對(duì)檸檬酸和辛烷磺酸鈉，平衡色譜柱和沖洗色譜柱需要時(shí)間長(zhǎng)，而且容易對(duì)色譜柱造成損害，色譜柱壽命較短，經(jīng)濟(jì)成本較高。本研究采用反反相色譜柱XBridgeTMhilic色譜柱，與傳統(tǒng)色譜柱相比其穩(wěn)定性和重現(xiàn)性更好，沒有采取離子對(duì)的流動(dòng)相，保護(hù)色譜柱，使三聚氰胺的分離具有完美的色譜峰形和最高柱效。

3 結(jié)論

本方法采用1%三氯乙酸溶液提取、固相萃取柱凈化，高效液相色譜法測(cè)定，成功建立了雞蛋中三聚氰胺的殘留檢測(cè)方法。此方法對(duì)樣品提取、凈化過程和儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，三聚氰胺的檢測(cè)限為0.5mg/kg，最低定量限為1mg/kg。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單、快速，回收率較高，適合樣品雞蛋中三聚氰胺殘留的定量檢測(cè)。

[1].李紅梅, 張慶合, 湯樺等.GB/T 22400-2008 原料乳中三聚氰胺快速液相色譜法[S].北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

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