鴨坦布蘇病毒高免卵黃抗體的研制

鄒曉娟 （山東省乳山市徐家獸醫(yī)站 264500）

自2010年4月份，鴨坦布蘇病毒病在我國浙江、福建、廣東、廣西、江蘇、山東、北京等主要養(yǎng)鴨地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)，該病毒可感染產(chǎn)蛋鴨、育成鴨和商品肉鴨，產(chǎn)蛋鴨發(fā)病表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量嚴(yán)重下降，可從90%以上降至10%以內(nèi)，嚴(yán)重的甚至絕產(chǎn)，患病后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死淘率升高，剖檢感染鴨可見明顯的卵泡出血和變性；育成鴨和商品肉鴨發(fā)病出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，轉(zhuǎn)圈，翻個站不起來，淘汰率在10%～30%，嚴(yán)重時可達(dá)到80%，剖檢可見腦組織病變，腦膜水腫、充血。該病傳播迅速、波及面廣，幾乎席卷了整個養(yǎng)鴨密集地區(qū)，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大損失[1,2]。目前，本病尚無有效的預(yù)防和治療措施。高免卵黃抗體的治療效果已在長期的臨床實(shí)踐中得到了認(rèn)可，特別在雞傳染性法氏囊、鴨病毒性肝炎等禽病的治療和預(yù)防中效果確實(shí)可靠，本試驗(yàn)嘗試?yán)螟喬共继K病毒滅活疫苗免疫試驗(yàn)雞，制備高免卵黃抗體來治療該病。通過雛鴨攻毒保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)制備卵黃抗體具有良好的預(yù)防與治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鴨坦布蘇病毒 由山東省農(nóng)科院家禽研究所分離保存。

1.1.2 SPF雞胚 由山東省農(nóng)科院家禽研究所提供。

1.1.3 試驗(yàn)用雞 由山東省威海市某蛋雞場提供。

1.2 方法

1.2.1 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)和雞胚最小致死量平均死亡時間(MDT)的測定 將鴨坦布蘇病毒分別做10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六個稀釋度，經(jīng)尿囊腔接種10d齡SPF雞胚，0.1ml/枚，各5枚，接種后7d內(nèi)觀察雞胚死亡情況，并用Reed-Muench法計(jì)算其ELD50。用滅菌生理鹽水將鴨坦布蘇病毒分別做10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六個稀釋度，每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0.1ml/枚。接種后的雞胚在37℃孵育7d，每天早晚各照胚1次，記錄每組雞胚的死亡時間。使所有雞胚死亡的最高稀釋度就是最小致死量(MLD)，MDT是MLD致死雞胚的平均時間。

1.2.2 制備高免卵黃抗體 將鴨坦布蘇病毒按100倍ELD50劑量、以絨毛尿囊膜的方式接種10日齡SPF雞胚，收集死亡的雞胚尿囊液和尿囊膜，混在一起，充分搗碎，凍融3次后離心取上清，甲醛滅活后制成油苗。疫苗免疫：200日齡試驗(yàn)蛋雞10只，第1次免疫油苗，0.5ml/只；間隔7d進(jìn)行第2次油苗免疫，1ml/只；再間隔10d進(jìn)行第3次油苗免疫，2ml/只，第3次免疫后15d開始揀蛋，通過雞胚中和試驗(yàn)測定其卵黃抗體效價。

1.2.3 雞胚中和試驗(yàn)測定卵黃抗體效價 收集第3次免疫后15d的免疫蛋，用滅菌生理鹽水將卵黃分別做101、102、103、104、105、106倍稀釋，分別與100倍ELD50的鴨坦布蘇病毒混合，37℃作用1h，接種10日齡SPF雞胚，0.2ml/枚，各5枚，同時設(shè)病毒對照組和102倍稀釋的陰性卵黃對照組，7d內(nèi)觀察雞胚死亡情況，并用Reed-Muench法計(jì)算卵黃抗體中和效價。

1.2.4 雛鴨攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將30只3日齡的雛鴨分成3組，10只/組：預(yù)防組：先經(jīng)頸部皮下注射高免卵黃抗體，0.5ml/只，24h后經(jīng)腿部肌肉注射103ELD50的鴨坦布蘇病毒；治療組：先經(jīng)腿部肌肉注射103ELD50的鴨坦布蘇病毒，12h后頸部皮下注射高免卵黃抗體，0.5ml/只；攻毒對照組：經(jīng)腿部肌肉注射103ELD50的鴨坦布蘇病毒。觀察并記錄雛鴨存活情況，并對死亡雛鴨進(jìn)行剖檢。

2 結(jié)果

2.1 雞胚半數(shù)致死量和最小致死量平均死亡時間

采用OIE規(guī)定的方法[3]對鴨坦布蘇病毒進(jìn)行毒力檢測，結(jié)果顯示，該病毒的雞胚ELD50為105.32/0.1ml，雞胚最小致死量平均死亡時間為107.5h。

2.2 卵黃抗體中和效價

不同卵黃稀釋度條件下雞胚存活情況見表1。根據(jù)雞胚存活情況，用Reed-Muench法計(jì)算卵黃抗體中和效價為1:103.5。

表1 接種7d內(nèi)雞胚存活情況

2.3 卵黃抗體保護(hù)雛鴨試驗(yàn)結(jié)果

攻毒12h內(nèi)有部分雛鴨出現(xiàn)死亡，去除這部分雛鴨，其余雛鴨120h內(nèi)存活情況見表2。結(jié)果表明，預(yù)防組的保護(hù)率達(dá)到90%，治療組的保護(hù)率達(dá)到78%。

表2 攻毒120h后各組雛鴨存活情況

3 小結(jié)

鴨坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，該病最早于2010年4月份發(fā)生在我國浙江、福建等地，隨后幾個月內(nèi)迅速蔓延到廣東、廣西、江蘇、山東、北京及東北地區(qū)，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨后幾年該病在我國許多養(yǎng)鴨地區(qū)均有流行，已經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病。由于國內(nèi)外對黃病毒感染尚缺乏有效的治療藥物和治療措施，因此目前鴨坦布蘇病毒病還沒有確實(shí)有效的治療方法。臨床上大多通過補(bǔ)充維生素和微量元素、后期通過飲水給以適當(dāng)?shù)目股胤乐渭?xì)菌繼發(fā)感染、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等措施進(jìn)行治療，但效果不佳[4～5]。特異性高免卵黃抗體對許多禽病的治療具有良好的效果，因此筆者嘗試?yán)寐腰S抗體來治療鴨坦布蘇病毒病，探究這種治療方法的可行性和有效性。由于鴨坦布蘇病毒不同分離株之間無明顯的抗原差異，因此只選擇了一株病毒進(jìn)行濃縮后制備了滅活疫苗，免疫產(chǎn)蛋試驗(yàn)雞，經(jīng)3次免疫后，收集免疫蛋，經(jīng)測定其中和效價高達(dá)103.5，說明成功制備了鴨坦布蘇病毒高免卵黃抗體。

通過雛鴨攻毒保護(hù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)制備的卵黃抗體具有良好的預(yù)防和治療鴨坦布蘇病毒病的作用，預(yù)防組的保護(hù)率達(dá)到90%，而治療組的保護(hù)率達(dá)到78%。這說明利用卵黃抗體來預(yù)防和治療鴨坦布蘇病毒病是可行的，其進(jìn)一步的療效還需要在實(shí)踐生產(chǎn)中加以驗(yàn)證。

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[2]李玉峰, 馬秀麗, 于可響等.一種從鴨新分離的黃病毒研究初報(bào)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 6: 885-891.

[3]世界動物衛(wèi)生組織.診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊[M].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.2004.

[4]胡旭東, 路浩, 劉培培等.我國發(fā)現(xiàn)的一種引起鴨產(chǎn)蛋下降綜合征的新型黃病毒[J].中國獸醫(yī)雜志, 2011, 7: 43-47.

[5]萬春和, 施少華, 程龍飛等.一種引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降新病毒的分離與初步鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 25(6): 663-666.