微生物發(fā)酵法生產D-木糖酸

（青島科技大學 化工學院，山東 青島 266042）

糖酸類目前越來越受到人們的關注。它可以用于生產共聚酰胺類化合物[1]也可以作為1,2,4-丁三醇[2]合成的前體物質。很多關于D-木糖酸的應用已經被申請專利。微生物生產D-木糖酸的觀點在19世紀末就已經被提出。多種假單胞菌屬，醋桿菌屬，氣桿菌屬，葡萄桿菌屬，歐文氏菌屬和相關菌種已經可以用來生產D-木糖酸[3]。細胞質中的D-木糖和D-葡萄糖脫氫酶類利用吡咯喹啉（PQQ）修復系統(tǒng)將電子傳遞給呼吸鏈上的細胞色素。這個過程會積累D-木糖酸和D-木糖酸內酯。D-木糖酸內酯是脫氫酶的直接產物，但是內酯會直接打開或者會在同種菌產生的內酯酶的參與下打開生成D-木糖酸。細胞質中的NAD+依賴型D-木糖脫氫酶將D-木糖氧化成D-木糖酸內酯[4]，再在內酯酶的作用下裂開生成D-木糖酸。D-木糖酸可能會脫水生成2-羰基-3-脫氧戊酸，并且進一步脫氫還原成α-酮戊二酸或者被醛縮酶裂解成丙酮酸鹽和羥乙醛。雖然目前在真菌中只有一種編碼D-木糖脫氫酶的基因得到了確認，但是已經有了關于酵母菌和其他一些真菌生產D-木糖酸的報道。

近來通過在各種酵母菌和大腸桿菌中導入D-木糖脫氫酶編碼基因來生產D-木糖酸。幾種D-木糖酸內酯酶基因序列近來已經得到確定，但是還沒有對這幾種酶進行深入研究。與細胞內D-木糖酸生產相關的線性傳輸機制或者菌體內的D-木糖酸的內酯形式目前還不明確。

除了本研究中所描述的微生物以外，D-木糖酸還可以通過酶法，電子化學方法或者化學氧化的方法生產[5]。在酸性亞硫酸鹽處理的木料漿液中也發(fā)現(xiàn)了D-木糖酸。然而，從木漿液中得到D-木糖酸的有效的分離方法還沒有建立起來。雖然D-木糖酸的很多應用已經被申請專利，其中包括從植物水解液中生產D-木糖酸粗品，但是工業(yè)化生產D-木糖酸仍然受到限制。筆者主要描述了利用細菌和真菌微生物生產D-木糖酸的現(xiàn)狀。

1 細菌發(fā)酵生產D-木糖酸

1.1 木質纖維素水解液

木質纖維的植物廢料可以為D-木糖酸的生產提供經濟的原材料[7]。已經就利用半纖維素水解液將D-木糖轉化成D-木糖酸的課題開展了若干次研究。研究發(fā)現(xiàn)氧化葡萄糖酸桿菌比惡臭假單胞菌更能耐受生物水解液中的毒素，但是其菌體生長和D-木糖酸的生產仍然受到高濃度木質纖維素水解液的抑制?？捎枚一ヌ崛∫侯A處理或混合床樹脂吸附或者離子排阻色譜法促使D-木糖在水解液中利用氧化葡糖糖酸桿菌轉化成D-木糖酸。其中利用離子排阻色譜的方法可使D-木糖酸的產量提高最多。Turkia也發(fā)現(xiàn)用氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵富含戊糖的麥稈兒水解液可以得到由D-木糖到D-木糖酸的低速率轉化[8]。這個過程中D-木糖到D-木糖酸的轉化不夠完全，每消耗1 gD-木糖只能得到0.7 gD-木糖酸。超灰處理麥稈兒水解液可以除去一些芳香族脂肪族化合物。這種方法可以有效的使水解液達到完全轉化。（即每消耗1 gD-木糖得到1.0 g的D-木糖酸）并且可以提高D-木糖酸的產率。僅1.0～1.5 g的菌體就可以得到1.1 g／L·h的木糖酸產率。這個速率只比用純D-木糖為原料生產D-木糖酸低一點，與用離子排阻色譜法處理過的水解液相當。相比之下，灰處理來自ABNT的干酒糟固體酸性水解液比未處理的水解液D-木糖到D-木糖酸的轉化率要低。

在稀釋率D=0.03／h的流動培養(yǎng)時，氧化葡萄糖酸產生D-木糖酸的速率可持續(xù)3天維持在0.32 g／L·h。然而，水解液中只有50%的D-木糖被轉化為D-木糖酸，并且菌體細胞會被破壞。（D-葡萄糖到D-葡萄糖酸的轉化率大約為76%）

1.2 產量和轉化率

雖然氧化葡萄糖酸桿菌D-木糖酸脫氫酶的最適PH是6，而D-木糖酸生產中所用pH為4.5甚至是 3.5。即使在菌體濃度很低（0.2 g／L·h）或者在無細胞生長的條件下在pH為4.5～6.5時，其生產率大概是 2 g／L·h[6]。在 pH5.6 條件下我們已經獲得的D-木糖酸的產量高達12 g／（g菌體）·h。

由于氧化葡萄糖酸桿菌需要復雜的生長培養(yǎng)基，且會將大部分的糖用于菌體生長，所以其他的一些菌種生產D-木糖酸可能會更經濟有效。例如葡糖醋桿菌被認為可以替代葡萄糖酸桿菌來生產D-木糖酸，因為其對營養(yǎng)物質的需求量小而且可耐受低 PH[9]。

基因工程菌生產D-木糖酸的第一例近來被述及。將來自新月柄桿菌的一個D-木糖脫氫酶編碼基因導入大腸桿菌W3110,并且阻斷D-木糖和D-木糖酸的代謝途徑，通過這種方法，他們可以在一個分批培養(yǎng)過程中從40 g／L的 D-木糖生產出39 g／L的D-木糖酸。

雖然對于連續(xù)生產D-木糖酸還沒有過相關報道，但是連續(xù)生產D-葡萄糖酸、2-羰基-L-古龍酸和2,5-二酮葡萄糖酸都已經被述及。Hardy描述了用D-葡萄糖或者乳酸鹽做底物在稀釋率D=0.2／h，pH6.8條件下提高假單胞菌的菌體產量時，D-木糖酸作為副產物其產率可達4／mmol(g菌體)·h。當D=0.04／h,pH5.5條件下利用氧化葡萄糖酸桿菌以40 g／L D-木糖和 20 g／L的 D-葡萄糖為底物我們觀察到產率為1.5 g／L·h的D-木糖酸的持續(xù)生產。同時還會有D-葡萄糖酸，醋酸鹽產生和菌體生長。在pH4.5的條件下的持續(xù)生產仍然可以進行。分批補料培養(yǎng)連續(xù)生產D-木糖酸的情況還沒有相關報道。

2 重組酵母細胞生產D-木糖酸

2.1 釀酒酵母和D-木糖脫氫酶的選擇

從里氏木霉中獲取NADP+依賴型木糖脫氫酶的目的基因，將其在釀酒酵母中表達，Toivari等描述了利用該重組酵母生產D-木糖酸的過程。該釀酒酵母基因工程菌可產生高達3.8 g／L的D-木糖酸。同時可產生4.8 g／L的副產物木糖醇，通過除去GRE3編碼的醛糖還原酶可以明顯降低該副產物產量[10]。雖然這證明了用酵母生產D-木糖酸具有可行性，但是相比于那些用細菌生產或者用釀酒酵母生產的其他酸類其滴度和速率都很低。

最初，試圖通過基因工程的方法改變氧化還原代謝途徑，以提高NADP+的循環(huán)，但是這種方法沒有提高D-木糖酸的產量。xylB基因具有更高的活力，而且對于D-木糖具有更高的特異性。xylB相比于xydl對于D-木糖酸產量的提高可能反映了其細胞質中脫氫酶具有更高的活力。然而，也可以說明產生了過量的NADH，NADH可以在電子傳遞鏈中被氧化從而積累能量，而過量NADH比NADPH更有助于D-木糖酸的生產。另一個需NADP+的D-木糖脫氫酶從煮沸中得到的SUS2DD在釀酒酵母中成功表達，表現(xiàn)與里氏木霉中xydl基因相似的活力和生產作用。

工業(yè)釀酒酵母菌株B67002xylB的表達使得D-木糖酸的生產比實驗室菌株具有更高的濃度（43 g／L）,速率達到 0.5 g／L·h,這個數(shù)據是葡萄糖酸桿菌和惡臭假單胞菌的25%～30%。

2.2 其他可生產D-木糖酸的酵母

將來自瑞士木霉的xydl酶在克魯維酵母中表達來生產D-木糖酸，但是xydl酶是NADP+依賴型的，并且其活力很低。雖然活力水平與那些觀察到的釀酒酵母中的酶相似，但是與表達同樣基因的釀酒酵母相比克魯維酵母能以更高的速率產生更多的D-木糖酸[12]。適當提高底物濃度可以提高產量，但是當提供更高的D-木糖濃度時，等量的釀酒酵母菌株不能提高D-木糖酸的產量。相比之下，除去釀酒酵母中的GRE3只會降低木糖醇的產生。利用克魯維酵母生產D-木糖酸，供氧會影響D-木糖向D-木糖酸、木糖醇、或者菌體量的轉化。供氧充足的條件下，D-木糖代謝也更高效，但是即使是低得溶氧濃度，D-木糖酸的滴度或產率不會降低。

克魯維酵母對植物廢料水解液的耐受能力不高，但是其生產D-木糖酸的能力很高，這證明了可以利用克魯維酵母替代釀酒酵母用D-木糖來生產D-木糖酸。

3 發(fā)酵法生產D-木糖酸的前景

雖然，非基因工程菌生產D-木糖酸的效率很高，但是既沒有相關的商業(yè)產品的描述，也沒有建立起經濟的大規(guī)模的分離過程。目前的一些方法，比如沉淀或者離子交換，只適用于比較純的溶液的小規(guī)模分離，不能滿足大規(guī)模生產D-木糖酸[13]。因為D-木糖酸沒有市場，所以沒有推動其大規(guī)模生產的動力。然而隨著對于替換D-葡萄糖酸的需求越來越迫切，人們對于大規(guī)模生產和提純D-木糖酸的關注將會越來越多。

氧化葡萄糖酸桿菌對營養(yǎng)的需求復雜，生物量增長慢，需要昂貴的接種過程。因此，即使D-木糖酸可以很快從植物廢料水解液中獲得，但是其生產仍然受到限制。若干關于提高氧化葡萄糖酸桿菌菌體生長量的專利已經發(fā)布了[14]，但是破壞周邊或者細胞質葡萄糖脫氫酶類的策略希望可以降低D-木糖酸的生產速率。熱殺索絲菌的接種技術相對成熟，但是需要多步操作才能從植物水解液中除去抑制物。葡糖醋桿菌可能是一種可行的替代菌，但是還沒有在水解液中做過測試。另一個值得關心的問題是木質纖維素水解液中產生的其他酸性產物的量以及分離提純所需的費用。

現(xiàn)在基因工程細菌和酵母菌的產生可替代非基因工程菌的大規(guī)模生產D-木糖酸并且可能有更進一步的發(fā)展?；蛑亟M后的大腸桿菌有更快的生產速率，更加有效地接種技術，菌體對營養(yǎng)要求低得優(yōu)點?；蛑亟M后的釀酒酵母和克魯維酵母也具有生長良好低營養(yǎng)要求的優(yōu)點。釀酒酵母和幾種其他的酵母還有對多種纖維素水解液抑制物耐受性好[15]，低PH耐受性好的特點?；蚬こ叹陌l(fā)展為工業(yè)生產D-木糖酸的發(fā)展打開了新的道路。

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