利用改進(jìn)的耐高溫酵母菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇的研究進(jìn)展

宋維霞

（青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042）

0 前 言

石油資源短缺、環(huán)境污染嚴(yán)重，已經(jīng)成為制約我國(guó)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。利用生物方法生產(chǎn)的生物乙醇，是傳統(tǒng)燃料石油最有前景的替代品。目前，世界上生產(chǎn)生物乙醇的原料大多數(shù)是淀粉和甘蔗汁，而以玉米為原料生產(chǎn)的第一代生物燃料乙醇，由于與人類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)糧食，已逐漸被淘汰[1]。從豐富的農(nóng)副產(chǎn)品和工業(yè)廢渣 (如甘蔗渣、玉米秸稈、小麥和水稻秸稈、木屑等)中獲得的木質(zhì)纖維素,都可用作生產(chǎn)生物乙醇的原料。

木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成。原料不同各部分的組成也會(huì)有所變化[2]。纖維素結(jié)晶形成的超細(xì)纖維結(jié)構(gòu)即無(wú)定形結(jié)構(gòu)，不易被真菌和細(xì)菌分泌的糖化酶水解。雖然經(jīng)過(guò)化學(xué)和物理方法預(yù)處理后的纖維素和半纖維素更容易和糖化酶反應(yīng)，但是由于纖維素的結(jié)構(gòu)相對(duì)堅(jiān)固，因此，尋求有效的纖維素水解方法仍然是利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵[3]。

纖維素水解成可溶性的糖，需要包括內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（包括纖維二糖水解酶（CBH）、纖維糊精酶）和 β-葡萄糖苷酶（BGL）的共同作用，然而反應(yīng)產(chǎn)物如纖維低聚糖和葡萄糖會(huì)抑制纖維素酶的活性[4]。為了避免上述的產(chǎn)物抑制，將生物質(zhì)水解產(chǎn)生還原糖與還原糖發(fā)酵一起進(jìn)行，這一過(guò)程被稱為同步糖化發(fā)酵（SSF）。這樣一方面，可以在纖維素酶的作用下將釋放的還原糖直接轉(zhuǎn)化為乙醇；另一方面，培養(yǎng)基中的葡萄糖的消耗和乙醇的存在將降低染菌的風(fēng)險(xiǎn)。聯(lián)合生物加工（CBP）工藝是將酶的生產(chǎn)、糖化和發(fā)酵集合成一體的新工藝。具有消耗低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。最近，CBP已經(jīng)作為一個(gè)生物乙醇生產(chǎn)系統(tǒng)得到了認(rèn)可，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)了能夠有效地水解纖維素、提高乙醇生產(chǎn)能力CBP微生物。

SSF和CBP工藝的瓶頸在于糖化和發(fā)酵階段所需的最佳溫度不同。纖維素糖化酶的最佳溫度為50℃，而大多數(shù)微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的最佳溫度是28～37℃。筆者將重點(diǎn)論述利用耐高溫酵母菌的SSF和CBP工藝。由于同步糖化發(fā)酵需要較高溫度，所以還特別強(qiáng)調(diào)了能在CBP工藝中直接將纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇的酵母菌的發(fā)展情況[5]。

1 耐高溫酵母菌同步糖化發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇

因?yàn)樵诟邷貤l件下生產(chǎn)乙醇有很多優(yōu)點(diǎn)如：降低冷卻成本、低壓下乙醇能從發(fā)酵液中連續(xù)蒸發(fā)、降低染菌風(fēng)險(xiǎn)、在熱帶國(guó)家有較好適用性、緩解纖維素酶的產(chǎn)物抑制、提高同步糖化發(fā)酵（SSF）的效率等，因此在世界上已備受關(guān)注。Abdel-Banat等[6]計(jì)算出利用α-淀粉酶水解淀粉生產(chǎn)燃料乙醇，當(dāng)發(fā)酵溫度增加5℃時(shí)，由于減少冷卻的能量，可以大大減少發(fā)酵成本。由于發(fā)酵過(guò)程中乙醇被蒸發(fā)，所以乙醇的濃度保持在較低水平，對(duì)酵母菌并沒(méi)有毒害，同時(shí)也可以簡(jiǎn)化后續(xù)的精餾操作。

同步糖化發(fā)酵工藝（SSF）的一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)是能避免葡萄糖對(duì)纖維素酶的抑制進(jìn)而提高糖化效率和乙醇產(chǎn)量。然而，SSF工藝的缺點(diǎn)是在較低的溫度下水解反應(yīng)和發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行比水解和發(fā)酵單獨(dú)進(jìn)行時(shí)水解效率低。因此，分離篩選在糖化溫度下產(chǎn)乙醇的耐熱菌是提高同步糖化發(fā)酵效率所必需的。耐熱酵母菌克魯維酵母（Kluyveromyces）和釀酒酵母（Saccharomyces），在高溫（＞ 40 ℃）下能產(chǎn)生超過(guò)5%的乙醇[7]。因?yàn)槟咎鞘前肜w維素中最常見(jiàn)的戊糖，是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中第二個(gè)最豐富的多糖。因此如果菌株除了耐熱之外還能夠直接以木糖為原料進(jìn)行發(fā)酵，那么將使以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇變得更加經(jīng)濟(jì)可行。

一些耐高溫和產(chǎn)乙醇的酵母已經(jīng)被優(yōu)化,用來(lái)更好的從生物質(zhì)中生產(chǎn)乙醇（表1）。例如，耐熱畢赤酵母：多形漢遜酵母 （Hansenula polymorpha），在溫度升高到 37℃或較高時(shí)能夠分解葡萄糖、纖維二糖和木糖生產(chǎn)乙醇。Dmytruk等[8]通過(guò)對(duì)內(nèi)源性木糖還原酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而提高多形漢遜菌對(duì)木糖的利用。在48℃時(shí)，重組菌株比野生型菌株產(chǎn)乙醇的量高7.3倍。多形漢遜酵母菌的這種性質(zhì)是SSF應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)。

馬克斯克魯維酵母 （Kluyveromyces marxianus）在同步糖化發(fā)酵工藝中非常有應(yīng)用前景。已經(jīng)得到的多株馬克斯克魯維酵母，能在溫度高達(dá)45～52℃時(shí)生長(zhǎng)，在溫度介于38℃和45℃時(shí)能有效地生產(chǎn)乙醇。耐熱的馬克斯克魯維酵母菌IMB3，在42℃時(shí)能發(fā)酵產(chǎn)生60～72 g/L的乙醇，這和工業(yè)上經(jīng)常使用釀酒酵母發(fā)酵得到的乙醇濃度相差無(wú)幾[9]。此外，馬克斯克魯維酵母在高溫下生長(zhǎng)率高、可以利用各種糖原料（例如：阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖）生產(chǎn)乙醇。正是由于具有這些優(yōu)點(diǎn)，馬克斯克魯維酵母已用于以工業(yè)相關(guān)的基礎(chǔ)原料（如甘蔗汁、青貯玉米汁、糖漿和乳清粉）生產(chǎn)乙醇。此外，還應(yīng)用于將經(jīng)過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理的各種木質(zhì)材料（楊樹(shù)、桉樹(shù)、甜高粱、甘蔗渣和小麥秸稈）轉(zhuǎn)化為乙醇。同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在42℃、100 g/L底物和15 FPU/g商業(yè)纖維素酶條件下進(jìn)行，經(jīng)過(guò)72～82 h發(fā)酵木質(zhì)纖維素產(chǎn)生16～19 g/L乙醇。基于預(yù)處理材料中葡萄糖的可利用量，乙醇產(chǎn)量為理論產(chǎn)量的50%～72%[10]。Banat等[11]驗(yàn)證40℃至50℃有利于馬克斯克魯維酵母IMB進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。耐熱的馬克斯克魯維酵母菌IMB3通過(guò)SSF工藝將進(jìn)行水熱預(yù)處理的柳枝稷轉(zhuǎn)化為乙醇。通過(guò)條件優(yōu)化，在45℃條件下，80 g/L的纖維素經(jīng)過(guò)168 h發(fā)酵，產(chǎn)生 22.5 g/L的乙醇,接近于理論產(chǎn)量的86%。

表1 在高溫下耐熱菌株通過(guò)SSF或CBP工藝水解纖維素和半纖維素生產(chǎn)乙醇的最新數(shù)據(jù)資料

最新分離出的耐熱的產(chǎn)乙醇菌即畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）IPE100，在 42 ℃利用葡萄糖產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量為的理論產(chǎn)量的85%。42℃時(shí)利用酶水解經(jīng)過(guò)發(fā)酵蒸汽爆破預(yù)處理過(guò)的玉米秸稈，乙醇產(chǎn)量為理論產(chǎn)量的93.8%。Kitagawa等[12]在耐酸、耐乙醇，耐熱菌畢赤酵母中構(gòu)建了一個(gè)棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶bgl基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化株在40℃，無(wú)需加入β-葡萄糖苷酶（BGL）的條件下，經(jīng)72 h同步糖化發(fā)酵100 g/L微晶纖維素，產(chǎn)生29 g/L的乙醇。P.kudriavzevii基因工程菌需要較少量的糖化酶，因此可以大大降低同步糖化發(fā)酵工藝中酶的成本。發(fā)酵過(guò)程中的各種形式的壓力包括低pH值和預(yù)處理產(chǎn)生的酸性發(fā)酵抑制劑（如醋酸，甲酸和乙酰丙酸）都會(huì)損害同步糖化發(fā)酵中的酵母菌，而酵母菌P.kudriavzevii的綜合忍受能力有明顯優(yōu)勢(shì)。耐熱的畢赤酵母菌在40℃條件下，發(fā)酵含有141 g/L蔗糖、15 g/L葡萄糖和9 g/L的果糖的甘蔗汁，產(chǎn)生71.9 g/L的乙醇。另外，畢赤酵母用于連續(xù)四個(gè)批次發(fā)酵后，仍然保持較高的生物活性。Oberoi等[13]報(bào)道了使用新分離的P.kudriavzevii HOP-1菌株通過(guò)SSF工藝以堿處理的秸稈為原料生產(chǎn)乙醇。在40℃時(shí)條件下P.kudriavzevii發(fā)酵150 g/L葡萄糖是傳統(tǒng)的釀酒酵母產(chǎn)乙醇的35%；而在45℃時(shí)則在200%以上。 用酶（20 FPU/g-纖維素酶，50 IU/g-β-葡萄糖苷酶和15 IU/g-果膠酶）水解堿處理的稻草，40℃時(shí)加入P.kudriavzevii進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，24 h后，乙醇濃度為24.25 g/L，是基于葡聚糖的理論產(chǎn)量的82%。

工業(yè)上常用來(lái)生產(chǎn)乙醇的釀酒酵母（S.cerevisiae），具有很高的乙醇耐受性，但不耐熱。用校對(duì)缺陷DNA聚合酶或紫外線 （UV）照射進(jìn)行篩查，獲得耐熱性的突變菌株，釀酒酵母突變體可在溫度高達(dá)40～42℃時(shí)生長(zhǎng)。通過(guò)基因組重排、原生質(zhì)體融合和紫外光照射相結(jié)合的方法提高了耐熱性、耐乙醇的釀酒酵母生產(chǎn)乙醇的效率。從熱帶地區(qū)分離出耐高溫釀酒酵母菌S.cerevisiaeTJ14，顯示出高溫（41℃）的生長(zhǎng)表型。在42℃條件下，在利用同步糖化發(fā)酵過(guò)程中使用絲狀菌孢霉產(chǎn)生的纖維素酶水解發(fā)酵含有66%的葡聚糖的161 g/L的造紙污泥有機(jī)材料，能夠產(chǎn)生40 g/L的乙醇。Harashima等[14]基于耐高溫釀酒酵母菌經(jīng)典遺傳分析，RSP5編碼的E3泛素連接酶和CDC19編碼的丙酮酸激酶，負(fù)責(zé)菌株的高溫生長(zhǎng)。

2 釀酒酵母中的纖維素酶基因的異源表達(dá)

CBP工藝中理想的微生物應(yīng)能糖化纖維素并利用糖生產(chǎn)酒精。由于釀酒酵母發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如：糖的消耗速度更快、乙醇產(chǎn)量高、乙醇和各種抑制劑的耐受性強(qiáng)。同時(shí)，釀酒酵母易于遺傳操作并且長(zhǎng)期用于食品和飲料工業(yè)，被公認(rèn)是安全的，所以釀酒酵母是CBP工藝中常用的菌種。

在一般情況下，結(jié)晶纖維素的高效降解需要水解酶的協(xié)同反應(yīng)，如內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、纖維二糖水解酶（CBH）和 β-葡萄糖苷酶（BGL）[4]。 由內(nèi)切葡聚糖酶優(yōu)先在纖維素的無(wú)定形區(qū)進(jìn)行隨機(jī)切割，產(chǎn)生還原性和非還原性末端，然后由纖維二糖水解酶作用釋放出纖維二糖；隨后在EG-CBH內(nèi)切外切酶協(xié)同作用下纖維素可被高效降解為可溶纖維二糖和纖維寡糖[15]。最后在β-葡糖苷酶的作用下將纖維寡糖分解為葡萄糖分子。由于纖維二糖和纖維低聚糖是纖維素水解的強(qiáng)效抑制劑，是纖維素水解過(guò)程的限速步驟,BGL則可以將纖維二糖和可溶性纖維糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。來(lái)源于真菌的BGL基因 （如從A.aculeatus獲得的BGL1、從Saccharmycopsis fibuligera獲得的BGL1、從黑曲霉獲得的bglA、從Candida wickerhamii獲得的bglB、從 Trichoderma reesei獲得的 bgl、和從 Endomyces fibuliger獲得的BGL1）已在釀酒酵母中異源表達(dá)。Gurgu等[16]報(bào)道：攜帶S.fibuligeraBGL1基因的工業(yè)酵母菌利用纖維二糖的能力取決于其積累BGL1的能力也取決于其遺傳背景。重組的釀酒酵母菌能夠表達(dá)纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)基因與分解纖維二糖和纖維糊精的細(xì)胞內(nèi)BGL基因，通過(guò)細(xì)胞在細(xì)胞外BGL將纖維糊精完全水解成葡萄糖。這意味著以纖維糊精為原料生產(chǎn)乙醇的效率已經(jīng)被提高。

纖維素酶直接參與纖維素水解反應(yīng)，通過(guò)纖維素酶基因的共表達(dá)能夠使纖維素直接生產(chǎn)乙醇。Den-Haan等[17]表達(dá)了兩個(gè)纖維素酶基因，從T.reesei中獲得的編碼 EG的基因和從S.fibuligera中獲得的編碼BGL的基因，兩個(gè)基因整合在釀酒酵母中得到的酵母菌，成功地以無(wú)定形纖維素（PASC）作為唯一的碳源生產(chǎn)乙醇。最近，基因編碼的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶（EGII）、酸性纖維素酶II（CBH II）和棘孢曲霉BGL1基因通過(guò)具有攜帶抗抗生素G418基因的單一載體集成到葡萄酒酵母菌的染色體上。重組得到的釀酒酵母菌可以直接利用經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈纖維素生產(chǎn)乙醇，而不需要額外的加入各種酶。

3 細(xì)胞表面工程技術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞表面工程，將目的蛋白和酵母的細(xì)胞壁蛋白融合表達(dá)，使目的蛋白固定在酵母細(xì)胞的表面。比較常用的細(xì)胞壁蛋白有α-凝集素和Flo1p蛋白[18]。細(xì)胞表面表達(dá)不僅可以有效提高酶活力的穩(wěn)定性，而且還可以將表達(dá)、純化和固定集合于一體，節(jié)省時(shí)間和資源[19]。Fujita等[20]利用純的纖維素原料如大麥β-葡聚糖和無(wú)定形纖維素生產(chǎn)乙醇，使用重組釀酒酵母菌細(xì)胞表面表達(dá)的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶 （EGII）和酸性纖維素酶II（CBH II）和棘孢曲霉BGL1而沒(méi)有而沒(méi)有添加其他的酶。利用無(wú)定形纖維素生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量為0.45 g/g，是理論產(chǎn)率的88.5%。最近，一個(gè)表達(dá)分解纖維素酶的二倍體酵母重組株被優(yōu)化，在不添加外源酶的條件下，分解經(jīng)過(guò)熱水預(yù)處理的100 g/L的水稻秸稈產(chǎn)生7.5 g/L乙醇。

利用酵母菌細(xì)胞表面工程表達(dá)纖維素酶具有以下優(yōu)點(diǎn)：①在細(xì)胞表面有多種纖維素酶協(xié)同水解纖維素，可增加糖的利用率產(chǎn)生更多的乙醇；②水解纖維素釋放的葡萄糖被酵母細(xì)胞表面吸收，糖濃度維持在較低水平，以減少污染、降低纖維素酶產(chǎn)物抑制的風(fēng)險(xiǎn)；③由于在培養(yǎng)基中的葡萄糖穩(wěn)態(tài)濃度可以保持接近于零，因此可減少葡萄糖的阻遏作用，促進(jìn)木糖的消耗；④酵母細(xì)胞酶的回收利用，降低酵母繁殖成本、減少酶的消耗[21]；⑤纖維素酶自動(dòng)固定化在酵母細(xì)胞表面上，只要酵母繼續(xù)生長(zhǎng)，該酶的活性則得以保持。

4 耐高溫酵母菌株在提高CBP工藝方面的應(yīng)用

纖維素酶的異源產(chǎn)物已經(jīng)以耐熱酵母菌為宿主得到表達(dá)。例如，一些外源基因已被引入馬克斯克魯維酵母并成功的得到表達(dá)。耐熱纖維素酶基因編碼的黑曲霉EG、嗜熱子囊菌BGL和CBH被引入馬克斯克魯維酵母NBRC1777基因組。馬克斯克魯維酵母中的相關(guān)基因，在甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）啟動(dòng)子的控制下成功的得到表達(dá)，并且酵母在溫度高達(dá)45～50℃生長(zhǎng)良好。重組菌株能夠利用100 g/L的纖維素產(chǎn)生43.4 g/L乙醇[22]。

為了提高纖維素的轉(zhuǎn)化效率，從里氏木霉中獲得的EGII和從棘孢曲霉中獲得的BGL1被共展示在重組馬克斯克魯維酵母細(xì)胞表面，在45℃條件下能夠利用53.4 g/L纖維二糖產(chǎn)生20.4 g/L的乙醇。在48℃、不加入其他纖維素酶的條件下，經(jīng)過(guò)12 h反應(yīng)，重組菌株能夠以10 g/L的纖維素β-葡聚糖為原料產(chǎn)生4.24 g/L乙醇；而在30℃條件下，乙醇量?jī)H為0.930 g/L即產(chǎn)量（生產(chǎn)每克乙醇需要消耗的β-葡聚糖克數(shù)）為0.47 g/g。這一結(jié)果表明使用該重組耐熱馬克斯克魯維酵母菌的細(xì)胞表面顯示耐熱性的纖維素酶，可以有效地實(shí)現(xiàn)在高溫下發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇。作為一般認(rèn)為是安全的（GRAS）微生物，馬克斯克魯維酵母，可在高溫下利用纖維素（見(jiàn)表1），因?yàn)樗谳^高的溫度下可以利用廣泛的碳源，迅速地進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。馬克斯克魯維酵母為改進(jìn)CBP工藝、提高乙醇產(chǎn)量做出重大貢獻(xiàn)[23]。

半纖維素是木質(zhì)纖維素中第二豐富的成分，與纖維素一起被用來(lái)生產(chǎn)乙醇。Voronovsky等[24]通過(guò)將XYN2（里氏木霉中編碼木聚糖酶的基因）和xlnD（黑曲霉中編碼β-木糖苷酶的基因）整合到多形漢遜酵母基因組中，得到的轉(zhuǎn)化體在48℃能夠在以樺木木聚糖作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且產(chǎn)生乙醇。Sakamoto等[25]通過(guò)構(gòu)建重組的釀酒酵母直接以水稻秸稈半纖維素為原料生產(chǎn)乙醇，不僅能通過(guò)內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶1的共同作用來(lái)水解半纖維素，也可通過(guò)表達(dá)出的樹(shù)干畢赤酵母木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和釀酒酵母中木酮糖激酶同化木糖。半纖維素降解酶在耐熱酵母菌細(xì)胞表面顯示出的應(yīng)用也將有助于提高以半纖維素為原料生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量。

5 結(jié)論與展望

通過(guò)基因工程獲得的具有纖維素水解活性的酵母使得利用CBP工藝以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇有突破性的提高。CBP工藝的主要缺點(diǎn)是糖化和發(fā)酵的最佳溫度的差異，而耐熱菌株的應(yīng)用可以克服這個(gè)缺點(diǎn)。耐高溫、產(chǎn)乙醇的酵母菌用于SSF工藝，使木質(zhì)纖維素在高溫下高效水解。有效的水解需要多種酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的結(jié)合并轉(zhuǎn)化進(jìn)入耐熱酵母菌中，這需要高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。因此，構(gòu)建多基因表達(dá)系統(tǒng)仍是進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

同時(shí)，細(xì)胞表面工程是在酵母細(xì)胞表面展示各種纖維素分解酶并有效地水解纖維素原料的有力工具，是應(yīng)用在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的一個(gè)新方向。已構(gòu)建的能夠利用木質(zhì)纖維素酵母菌，可有效地將來(lái)源豐富的纖維素廢料轉(zhuǎn)化新的生物能源，因此具有極其重要的意義。

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