響應(yīng)面優(yōu)化魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性

羅春艷，吳楊陽(yáng)，孫海燕,2，余 輝，江旭華，陳小娥,2,*

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316022；3.浙江富丹旅游食品有限公司，浙江 舟山 316104）

響應(yīng)面優(yōu)化魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性

羅春艷1，吳楊陽(yáng)1，孫海燕1,2，余 輝1，江旭華3，陳小娥1,2,*

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316022；3.浙江富丹旅游食品有限公司，浙江 舟山 316104）

目的：研究秘魯魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性。方法：以水解度和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）自由基與·OH清除率及亞鐵還原能力評(píng)價(jià)其酶解產(chǎn)物抗氧化活性以及通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和凝膠排阻色譜分析其分子質(zhì)量分布。結(jié)果：最適酶解工藝為酶解溫度50 ℃、初始pH 7.4、底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2%、酶解時(shí)間3.7 h、酶添加量3 000 U/g。在此條件下，水解度和酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率分別為（37.23±0.08）%和（43.61±0.09）%，對(duì)ABTS+·和·OH清除率的IC50分別為0.37 mg/mL和0.41 mg/mL，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的亞鐵還原能力；SDS-PAGE顯示最適酶解工藝下，蛋白質(zhì)基本被水解為小分子多肽；凝膠排阻色譜分析可知，酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量在1～5 kD之間。結(jié)論：酶解產(chǎn)物具備較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為抗氧化活性物質(zhì)基料，充分開發(fā)利用。

魷魚須脫皮液；酶解；抗氧化；水解度；半抑制濃度

我國(guó)遠(yuǎn)洋捕撈魷魚種類主要有秘魯魷魚、阿根廷魷魚和北太平洋魷魚。秘魯魷魚是至今為止發(fā)現(xiàn)個(gè)體最大、資源最充足的原料之一，已成為浙江省水產(chǎn)加工的主要品種，僅2014年其捕撈量就高達(dá)37萬(wàn) t，占浙江省遠(yuǎn)洋魷魚捕撈量一半以上[1-3]。因秘魯魷魚須表皮深黑、厚實(shí)、吸盤難脫除等問(wèn)題，致使其深加工一直受到限制，因此，如何對(duì)其進(jìn)行脫皮是秘魯魷魚須深加工目前面臨的首要問(wèn)題[4-5]。課題組前期對(duì)魷魚須酶法脫皮工藝進(jìn)行了深入研究，建立了秘魯魷魚須胰酶脫皮工藝[6]，該工藝已在當(dāng)?shù)仄髽I(yè)逐步推廣應(yīng)用。但在企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生了大量的脫皮液，其含有豐富的維生素、微量元素、不飽和脂肪酸和?；撬岬葼I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7]，一般直接排入城市污水處理系統(tǒng)，不僅浪費(fèi)資源，而且還需支付昂貴的排污費(fèi)用[8]。因此，對(duì)其進(jìn)行有效開發(fā)利用，提高其附加值成為水產(chǎn)加工企業(yè)急需解決的問(wèn)題。

目前，有關(guān)魷魚須脫皮廢液深加工利用的研究相對(duì)較少，如從魚糜漂洗液等廢水中回收蛋白質(zhì)[9-11]或蛋白酶[12]；利用鯖魚罐頭蒸煮液開發(fā)調(diào)味品[13-15]或制備抗氧化肽[16]等。迄今為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)魷魚須脫皮液深加工利用研究鮮見報(bào)道。研究表明，脫皮液中富含蛋白質(zhì)，特別含有大量的膠原蛋白[17-18]。因此，針對(duì)魷魚須脫皮液的成分特性，本實(shí)驗(yàn)利用商業(yè)化的膠原蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解以制備具有抗氧化活性的膠原肽，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，并分析了最適工藝條件下酶解產(chǎn)物的抗氧化活性及通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜觀察酶解效果，利用凝膠排阻色譜分析其分子質(zhì)量分布，以期為魷魚資源深度開發(fā)及其下腳料的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魷魚須脫皮液（-20 ℃冰箱保存） 浙江富丹旅游食品有限公司；膠原蛋白酶（2×105U/g）南寧龐博生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS） 美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-601型超級(jí)恒溫水浴鍋 常州市頂新實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BS110S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；pHS-3B型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2800型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AKTA purifier100蛋白純化系統(tǒng) 瑞典Amersham Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 魷魚須脫皮液酶解單因素試驗(yàn)

考察底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間及酶添加量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響。酶解基本條件為：酶解溫度50 ℃、初始pH 7.4、底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、酶解時(shí)間3 h、酶添加量3 000 U/g（酶解溫度和初始pH值的固定水平根據(jù)酶的性質(zhì)選定），其中單因素底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為1%、2%、3%、4%、5%，酶解時(shí)間設(shè)定為1、2、3、4、5 h，酶添加量設(shè)定為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g（以蛋白計(jì)）。待反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min，冰浴冷卻，冷凍保存。

1.3.2 魷魚須脫皮液酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以水解度和酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，選取底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、酶解時(shí)間（B）、酶添加量（C）為試驗(yàn)因子，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)中心設(shè)計(jì)原理，利用軟件Design-Expert V 8.0.6對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，獲得魷魚須脫皮液最佳酶解工藝條件。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 基本成分測(cè)定

蛋白質(zhì)含量按GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[19]中凱氏定氮的方法測(cè)定；羥脯氨酸含量按DB 37/T 2094—2012《水產(chǎn)品中羥脯氨酸含量的測(cè)定 高效液相色譜法》[20]中高效液相色譜的方法測(cè)定；脂肪含量按GB/T 9695.7—2008《肉與肉制品 總脂肪含量測(cè)定》[21]中酸解法的方法測(cè)定；總糖含量按GB/T 9695.31—2008《肉制品 總糖含量測(cè)定》[22]中分光光度法測(cè)定；灰分含量按GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》[23]的方法測(cè)定。

1.3.3.2 水解度測(cè)定

水解度按Guerard等[24]的方法測(cè)定。

1.3.3.3 抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除率按Tepe等[25]的方法測(cè)定；ABTS+·清除率按Wang Bin等[26]的方法測(cè)定；·OH清除率按Wang Jingfeng等[27]的方法測(cè)定；亞鐵還原能力采用鐵氰化鉀還原法[28]測(cè)定。

1.3.4 分子質(zhì)量分布測(cè)定

SDS-PAGE按Gómez-Guillén等[29]的方法進(jìn)行分析，酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布采用凝膠排阻色譜法[30]測(cè)定，洗脫體積-分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方程為：y＝16 966-722.35x，R2＝0.999 3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 8.5軟件繪圖，應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Tukey法檢驗(yàn)差異顯著性，顯著性水平為α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 魷魚須脫皮液基本成分

表1 魷魚須脫皮液基本成分Table 1 Basic components of squid tentacle peeling liquid %

由表1可以看出，魷魚須脫皮液中主要成分為蛋白質(zhì)，含量高達(dá)15.18%，而通過(guò)羥脯氨酸計(jì)算出膠原蛋白含量為10.08%，即膠原蛋白占總蛋白的66.40%，與王燕[31]的結(jié)果一致，由此可見魷魚須脫皮液中膠原蛋白含量高。因此，本實(shí)驗(yàn)選用商業(yè)化膠原蛋白酶對(duì)其酶解，從而制備抗氧化活性膠原肽。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖1表明，酶解產(chǎn)物的水解度和DPPH自由基清除率均隨底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，當(dāng)?shù)孜锏鞍踪|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，其水解度和DPPH自由基清除率分別為34.27%和40.75%，進(jìn)一步提高底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，兩者均無(wú)顯著變化（P＞0.05），因此選用底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%左右。

圖1 底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 1 Effect of substrate protein concentration on DPPH radical scavenging capacity and DH

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖2 酶解時(shí)間對(duì)水解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH radical scavenging capacity

通過(guò)圖2發(fā)現(xiàn)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的水解度逐步增大，當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，無(wú)顯著增大（P＞0.05），同時(shí)DPPH自由基清除率也隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，逐步增大，水解5 h時(shí)，無(wú)顯著增大（P＞0.05），因此，綜合考慮水解度和DPPH自由基清除率，選擇酶解時(shí)間為3～4 h為宜。

2.2.3 酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖3 酶添加量對(duì)水解液水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 3 Effect of enzyme dosage on DH and DPPH radical scavenging capacity

由圖3可知，酶解產(chǎn)物的水解度和DPPH自由基清除率均隨酶添加量的提高而逐漸增大，當(dāng)酶添加量為3 000 U/g時(shí)，其水解度和DPPH自由基清除率分別為36.24%和42.41%，繼續(xù)增加酶量，兩者均無(wú)顯著增大（P＞0.05），故適宜的酶添加量為3 000 U/g左右。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水解度和DPPH自由基清除率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

使用Design-Expert V 8.0.6軟件建立響應(yīng)值對(duì)自變量編碼值的二次回歸模型方程：

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?shí)際有效性，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3、4。通過(guò)表3分析可知，兩個(gè)模型的P＜0.000 1和P＝0.000 3，說(shuō)明這兩個(gè)模型極顯著；失擬項(xiàng)的P＝0.243 2＞0.05和P＝0.081 5＞0.05，不顯著；對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)模型的相關(guān)系數(shù)分別為R2＝0.976 4＞0.95和R2＝0.963 9＞0.95，說(shuō)明模型擬合程度較好；變異系數(shù)分別為0.18%和0.25%，可知兩個(gè)模型都能較好地反映真實(shí)試驗(yàn)值。因此，可用這兩個(gè)模型對(duì)魷魚須脫皮液膠原蛋白酶的酶解效果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

分析這兩個(gè)模型各個(gè)系數(shù)的P值，發(fā)現(xiàn)因素A、C、AC、A2、B2對(duì)水解度的影響極顯著（P＜0.01），因素A、B、C、B2對(duì)DPPH自由基清除率的影響極顯著（P＜0.01）；因素BC、C2對(duì)水解度的影響顯著（P＜0.05），因素BC、A2對(duì)DPPH自由基清除率影響顯著（P＜0.05）。

表3 回歸模型的方差分析（水解度為響應(yīng)值）Table 3 Analysis of variance of the regression model with DH as response value

表4 回歸模型的方差分析（DPPH自由基清除率為響應(yīng)值）Table 4 Analysis of variance of the regression model with DPPH radical scavenging capacity as response value

通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)回歸模型得到各響應(yīng)面和等高線圖（圖4～6），圖中橢圓排列越稀疏，說(shuō)明因素變化對(duì)結(jié)果影響越小，反之；響應(yīng)面坡度越陡，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)工藝參數(shù)的變化越敏感，該參數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大，反之；等高線的形狀可反映交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形反之[32]。通過(guò)觀察圖4～6可知：交互項(xiàng)中底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶添加量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的響應(yīng)面坡度最陡，說(shuō)明底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶添加量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大；底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間之間交互的等高線圖成圓形，說(shuō)明底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間的交互作用可忽略。此結(jié)果與二次回歸方程得到的結(jié)果相一致。

結(jié)合模型和響應(yīng)面曲線圖分析，得到魷魚須脫皮液膠原蛋白酶酶解較合適的工藝參數(shù)為：底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.125%、酶解時(shí)間3.735 h、酶添加量3 000 U/g，預(yù)測(cè)的水解度與DPPH自由基清除率分別為37.27%、43.64%，為了實(shí)際操作方便，選取底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2%、酶解時(shí)間3.7 h、酶添加量3 000 U/g，在此條件下，進(jìn)行6次重復(fù)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得到水解度與DPPH自由基清除率分別為（37.23±0.08）%、（43.61±0.09）%，與回歸方程所得的水解度與DPPH自由基清除率的相對(duì)誤差分別為0.11%和0.07%，以上驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠、有效，能較好預(yù)測(cè)魷魚須脫皮液酶解產(chǎn)物的水解度與DPPH自由基清除率。

圖4 底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots for the effect of substrate protein concentration and hydrolysis time on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

圖5 底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶添加量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots for the effect of substrate protein concentration and enzyme dosage onhydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

圖6 酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis time and enzyme dosage on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

2.4 魷魚須脫皮液酶解產(chǎn)物抗氧化活性評(píng)價(jià)

圖7 魷魚須脫皮液酶解產(chǎn)物抗氧化活性Fig. 7 Antioxidant activities of squid tentacle peeling liquid

由圖7可知，隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化活性也逐漸升高，其中對(duì)ABTS+·與·OH均具有較強(qiáng)的清除能力，即IC50分別為0.37 mg/mL和0.41 mg/mL。Cai Luyun等[33]研究了草魚皮的3種抗氧化肽Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys （640.74 D）、Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu（618.89 D）、Val-Gly-Gly-Arg-Pro （484.56 D）的ABTS+·清除率IC50值分別為0.18、0.33、0.47 mg/mL；王雨生等[34]研究了黃鰭金槍魚皮膠原肽的抗氧化活性，其·OH清除率的IC50為0.39 mg/mL，與之相比，本實(shí)驗(yàn)?zāi)z原肽的ABTS+·與·OH清除率低于以上研究結(jié)果，有可能是因?yàn)楸久附猱a(chǎn)物是粗提物所致；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL時(shí)，膠原肽的OD700nm值為0.53，而賈建萍等[35]報(bào)道的三文魚皮，在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，膠原肽的OD700nm值為0.41，由此可見，本魷魚須脫皮液膠原肽具有較好的抗氧化活性。

2.5 酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

SDS-PAGE圖譜顯示（圖8a），在最適的酶解工藝下，蛋白條帶基本消失，說(shuō)明魷魚須脫皮液中的蛋白質(zhì)基本被水解成小分子多肽，證實(shí)此酶解工藝較好。為進(jìn)一步分析酶解液多肽的分子質(zhì)量分布，采用凝膠排阻色譜對(duì)酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，由圖8b可知，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量多集中在1～5 kD之間，占49.90%，進(jìn)一步證明了SDS-PAGE圖譜的結(jié)果。

圖8 膠原肽的分子質(zhì)量分布圖譜Fig. 8 Molecular weight distribution of collagen-derived peptides

3 結(jié) 論

為了解決企業(yè)在加工魷魚須過(guò)程中產(chǎn)生的脫皮液處理問(wèn)題，對(duì)其進(jìn)行有效開發(fā)利用，提高其附加值，節(jié)約資源，為魷魚資源深度開發(fā)及其下腳料的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究采用膠原蛋白酶對(duì)魷魚須脫皮液進(jìn)行酶解，得到最適工藝為：酶解溫度50 ℃、底物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2%、酶解時(shí)間3.7 h、酶添加量3 000 U/g、初始pH 7.4，此時(shí)樣品的水解度與DPPH自由基清除率分別為（37.23±0.08）%和（43.61±0.09）%?？寡趸钚栽u(píng)價(jià)結(jié)果表明該酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的ABTS+·清除率與·OH清除率，它們的IC50分別為0.37 mg/mL和0.41 mg/mL，且具有一定的亞鐵還原能力；SDS-PAGE顯示：最適酶解工藝下，魷魚須脫皮液中的蛋白質(zhì)基本被水解成小分子多肽；凝膠過(guò)濾層分析可知：酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量多集中在1～5 kD之間。因此，酶解產(chǎn)物具備較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為抗氧化活性物質(zhì)基料充分開發(fā)利用。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Collagen-Rich Waste Liquid from Squid Tentacle Peeling for Preparing Antioxidant Peptides Using Response Surface Methodology and Their Antioxidant Activities

LUO Chunyan1, WU Yangyang1, SUN Haiyan1,2, YU Hui1, JIANG Xuhua3, CHEN Xiaoe1,2,* (1. School of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Joint Key Laboratory of Zhejiang Province for the Research of Fishery Processing Technology, Zhoushan 316022, China; 3. Zhejiang Fudan Tourism Food Co. Ltd., Zhoushan 316104, China)

Objective: To investigate the optimum parameters for enzymatic hydrolysis of collagen-rich waste liquid from squid (Dosidicus gigas) tentacle peeling and evaluate the antioxidant activity of its hydrolysate. Methods: The hydrolysis parameters were optimized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and degree of hydrolysis (DH). The antioxidant activity of hydrolysate was evaluated by using scavenging rate of 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt radical (ABTS+·) and hydroxyl radical scavenging and ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assays and the molecular weight distribution was analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and gel filtration chromatography. Results: The optimal hydrolysis parameters were determined as follows: hydrolysis temperature, 50 ℃; substrate (protein) content, 3.2%; hydrolysis time, 3.7 h; enzyme dosage, 3 000 U/g; and initial pH, 7.4, resulting in a DH value of (37.23 ± 0.08) % and a scavenging rate of DPPH radical of (43.61 ± 0.09) %, respectively. The half inhibitory concentrations for ABTS+· and hydroxyl radical scavenging ability (IC50) of the hydrolysate obtained were 0.37 and 0.41 mg/mL, respectively. Moreover, the product showed a strong reducing capacity. SDS-PAGE analysis showed that most collagens in the waste liquid were hydrolyzed into small peptides with molecular weight of 1-5 kD as determined by gelexclusion chromatography. Conclusion: The hydrolysate derived from waste liquid from squid tentacles peeling has strong antioxidant activity and could be used as a functional seafood condiment and nutritional supplement for further development and utilization.

waste liquid from squid tentacle peeling; enzymatic hydrolysis; antioxidant activity; degree of hydrolysis; half inhibitory concentration

10.7506/spkx1002-6630-201621030

TS254.4

A

1002-6630（2016）21-0176-07

羅春艷, 吳楊陽(yáng), 孫海燕, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化魷魚須脫皮液膠原肽酶解工藝及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 176-182. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621030. http://www.spkx.net.cn

LUO Chunyan, WU Yangyang, SUN Haiyan, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of collagen-rich waste liquid from squid tentacle peeling for preparing antioxidant peptides using response surface methodology and their antioxidant activities[J]. Food Science, 2016, 37(21): 176-182. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621030. http://www.spkx.net.cn

2016-01-07

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C31106）；舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016C41022）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201310340009）

羅春艷（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。E-mail：992351360@qq.com

*通信作者：陳小娥（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ筚Y源綜合利用。E-mail：xiaoechen@163.com