利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞與絲素蛋白修復(fù)缺損髁突軟骨的研究進(jìn)展

張 衛(wèi)，張 敏

（1.河北北方學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，河北 張家口 075000；2.張家口教育學(xué)院醫(yī)學(xué)系，河北 張家口 075000）

以生物支架材料為核心，結(jié)合細(xì)胞建立三維空間復(fù)合體，一直是組織工程的核心，作為其研究的兩大構(gòu)成元素之一的支架材料為細(xì)胞的生長、繁殖、新陳代謝提供支持?，F(xiàn)階段研究較多的有膠原、纖維蛋白、甲殼素等天然材料，也有聚乳酸、聚羥基乙酸等人工合成高分子材料［1］。作為常用材料的絲素蛋白，具有良好的生物相容性及機(jī)械特性，在臨床各類組織缺損、新型組織工程材料及生物材料的研發(fā)及應(yīng)用方面有更大潛力。作為另一重要組成元素的種子細(xì)胞，也從最開始的終末細(xì)胞，如軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞，拓展到具有多向分化潛能的干細(xì)胞。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是成體骨髓中的具有多向分化潛能組織干細(xì)胞，在體外，經(jīng)適宜的誘導(dǎo)環(huán)境具有可分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及肌肉、肌腱等結(jié)締組織細(xì)胞的潛能，其獲得容易，受損傷小，逐漸成為近年來組織工程種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)［2］。

1 絲素蛋白性能

1.1 絲素蛋白的性質(zhì)

絲素蛋白是蠶體內(nèi)所分泌的絲液凝固而成，是天然高分子纖維蛋白，由甘氨酸 （gly）、丙氨酸 （ala）和絲氨酸 （ser）等18種氨基酸組成，約占蠶絲質(zhì)量的80%以上［3］。絲素蛋白本身具有良好的機(jī)械性能、理化性質(zhì)和生物學(xué)性能，經(jīng)過不同處理可以得到不同的形態(tài)，如溶液、膜以及纖維等［4］。經(jīng)長時(shí)間研究與應(yīng)用，利用絲素蛋白膜為載體，絲素蛋白可用于固定化酶和抗體；利用其特殊的多孔性網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)，絲素蛋白具有良好的吸附和緩釋功能，可用于藥物緩釋載體；鑒于絲素蛋白本身優(yōu)良的生物相容性能，絲素蛋白廣泛應(yīng)于于人造血管及人造皮膚等人造器官的臨床應(yīng)用［5］。長期臨床研究表明，絲素蛋白對(duì)細(xì)胞有良好的吸附作用，對(duì)維持細(xì)胞功能也有重要作用，其良好的生物相容性和表面活性，獨(dú)特的三維空間復(fù)合結(jié)構(gòu)是也為細(xì)胞立體培養(yǎng)提供了天然支架。

1.2 絲素蛋白經(jīng)改性后在組織工程學(xué)中的應(yīng)用

絲素蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)決定了它在組織工程材料中的廣泛應(yīng)用，但由于本身分子結(jié)構(gòu)中的大分子肽鏈中肽鍵及不穩(wěn)定的側(cè)鏈的存在，影響絲素蛋白的應(yīng)用。為進(jìn)一步提高絲素蛋白的表面性能，提高其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，常采取共混改性、化學(xué)接枝改性、化學(xué)交聯(lián)等方法對(duì)其進(jìn)行改性處理［6］。

Gupta等［7］將絲素蛋白溶解于特殊的 “離子溶液”，將成拓?fù)湫螤畹闹Ъ懿牧嫌糜诩?xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果表明其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞生長、增殖、分化和表達(dá)有影響，但無副作用，該項(xiàng)研究為絲素蛋白作為生物材料提供了多元化的應(yīng)用前景。Hu等［8］報(bào)道了重組類人膠原與絲素蛋白共混支架用于肝組織工程的研究。重組類人膠原加入絲素蛋白共混后，不但親水性增加，而且保持了原有的機(jī)械性能。Meinel等［9］將絲素蛋白進(jìn)行精－甘－天冬氨酸三肽 （Arg-Gly-Asp，RGD）修飾，并與修飾前的絲素蛋白和膠原作比較，觀察體內(nèi)、體外炎性反應(yīng)。研究表明，這兩種絲素蛋白膜在體外培養(yǎng)條件下可使人BMSCs產(chǎn)生低水平IL-1β和前列腺素E2，而且RGD修飾的絲素蛋白效果更加明顯。

蠶絲由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，去掉絲膠蛋白后會(huì)降低絲素蛋白的機(jī)械屬性。Liu等［10］使用去甲二氫愈創(chuàng)木酸作為交聯(lián)劑使絲素蛋白保持自然的機(jī)械屬性，在體內(nèi)和體外比較脫膠后的絲素蛋白和用去甲二氫愈創(chuàng)木酸改性后的絲素蛋白的物理性質(zhì)和生物相容性，研究發(fā)現(xiàn)改性后其機(jī)械性能和膨脹性增加，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明改性后無免疫炎性反應(yīng)。

2 骨髓基質(zhì)細(xì)胞

以生物支架材料為核心，將選取的種子細(xì)胞二者結(jié)合形成三維空間復(fù)合體，經(jīng)培養(yǎng)促使種子細(xì)胞生長、繁殖，形成與所選取種子細(xì)胞本體自身組織結(jié)構(gòu)和生理功能相似的組織，從而修復(fù)組織缺損。作為種子細(xì)胞的選擇，應(yīng)盡量避免本體自身的免疫排斥反應(yīng)，最大程度地提高生物安全性，生物穩(wěn)定性及生物相容性，基于如上考慮，自體軟骨細(xì)胞在組織工程學(xué)的初始階段，被認(rèn)為是理想的細(xì)胞來源。但是長期研究表明，軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中存在擴(kuò)增能力有限及難以保持其表型的缺點(diǎn)［11］，不能滿足研究及實(shí)際需要。而骨髓基質(zhì)細(xì)胞這一成體骨髓中的具有多向分化潛能組織干細(xì)胞，經(jīng)適宜的體外誘導(dǎo)環(huán)境，即可分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及肌肉、肌腱等結(jié)締組織細(xì)胞，亦可轉(zhuǎn)分化成心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或肌細(xì)胞的前體細(xì)胞群BMSCs［12］。因其獲得容易、受損傷小、具有長時(shí)間的體外擴(kuò)增能力和多向分化的潛能，在體外培養(yǎng)過程中擴(kuò)增能力強(qiáng)，表型保持能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為近年來組織工程種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。在研究中，可以采用把碳、洋紅等顆粒吸附于細(xì)胞的簡單方法，也可采用導(dǎo)入放射性同位素的方法用于細(xì)胞群的標(biāo)記，通過細(xì)胞追蹤，觀察BMSCs在髁突軟骨全層缺失區(qū)分化為成熟的軟骨細(xì)胞的程度及修復(fù)效果，從而評(píng)定BMSCs與絲素蛋白相結(jié)合修復(fù)缺損的髁突軟骨的效果［13］。

在BMSCs向軟骨誘導(dǎo)分化的過程中，經(jīng)常采用的誘導(dǎo)方法包括給與各種物理技術(shù)，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、微循環(huán)誘導(dǎo)和添加各種化學(xué)因子等方法。其中采用各種化學(xué)因子誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)效果穩(wěn)定且成功率明顯高于其他幾種方法。經(jīng)常使用的外源性生長因子有TGF－β［14］、IGF-I［15］、BMPs、FGFs等。這些外源性生長因子作為信號(hào)物質(zhì)參與了其中的精細(xì)調(diào)節(jié)，但是在實(shí)際操作中，經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞脫離了體內(nèi)的三維立體結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)行為受到影響，容易發(fā)生變異［16］。顳下頜關(guān)節(jié)作為人體最復(fù)雜的關(guān)節(jié)之一，其解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能運(yùn)動(dòng)多樣，在各種因素的作用下易于發(fā)生病變。在如此復(fù)雜的解剖環(huán)境中，尤其是在病變關(guān)節(jié)區(qū)炎性水解酶和腫瘤壞死因子 （TNF）及白細(xì)胞介素-1，6（IL-1，IL-6）的作用下，BMSCs在體外經(jīng)外源性生長因子定向誘導(dǎo)過程中所形成的特異性細(xì)胞基質(zhì)少，而且細(xì)胞生長速度慢，提示細(xì)胞的活力降低［17］。以BMSCs在自體軟骨細(xì)胞基質(zhì)的誘導(dǎo)下修復(fù)山羊缺損的髁突軟骨為例，修復(fù)后的山羊顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨面的全層缺失，說明采用經(jīng)體外各種化學(xué)因子誘導(dǎo)的二維培養(yǎng)誘導(dǎo)后的BMSCs在山羊顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨缺失區(qū)難以達(dá)到修復(fù)目的［18］。在實(shí)驗(yàn)組中，由少量的軟骨細(xì)胞形成的軟骨微環(huán)境在其中發(fā)揮了作用。目前已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)：由少量的軟骨細(xì)胞形成的軟骨微環(huán)境在裸鼠體內(nèi)皮下區(qū)及體外培養(yǎng)環(huán)境中均可誘導(dǎo)BMSCs形成軟骨。周廣東等［19］應(yīng)用BMSC與體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞按一定比例 （6∶4或7∶3）混勻并取一定數(shù)量細(xì)胞注射到裸鼠皮下：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：混合細(xì)胞組形成的軟骨組織明顯較相同數(shù)量的單純軟骨細(xì)胞組的體積大，且具有較高的蛋白聚糖含量，而單純BMSCs組僅形成了纖維性組織，在體外培養(yǎng)環(huán)境中也得到了類似的結(jié)果［20］。基于如上研究，可認(rèn)為，在其實(shí)驗(yàn)中可能存在：①顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)的微環(huán)境在BMSCs分化方面發(fā)揮重要誘導(dǎo)作用；②在顳下頜關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)囊中的滑液及病變關(guān)節(jié)區(qū)炎性水解酶和腫瘤壞死因子 （TNF）及白細(xì)胞介素-1，6（IL-1，IL-6）對(duì)BMSCs分化有直接的影響作用；③關(guān)節(jié)囊內(nèi)的滑液有著營養(yǎng)BMSCs或者誘導(dǎo)BMSCs分化的能力。

綜上所述，以組織工程學(xué)的技術(shù)來修復(fù)缺損的骨組織，為臨床骨組織缺損的修復(fù)提供了新的思路和新途徑，對(duì)于提高患者生存質(zhì)量，有著極其重要的作用。但如何提高誘導(dǎo)效率，如何制取可以代替人體骨組織缺損的組織工程學(xué)新產(chǎn)品涉及的問題較多，還需進(jìn)一步研究。

［1］王宏亮，韓東.生物材料復(fù)合支架與運(yùn)動(dòng)性關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)［J］.中國組織工程研究與臨床應(yīng)用，2011，15（8）：1475-1478.

［2］吳志明，王東，果樹偉.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用骨科雜志，2007，13（8），472-474.

［3］侯愛芹，史雅琪，謝孔良.絲素蛋白的提取及其在紡織上的應(yīng)用進(jìn)展［J］.紡織工業(yè)，2009，4：63-67.

［4］陳彥雄，陳敏，朱譜新，等.絲素蛋白的研究和應(yīng)用進(jìn)展［J］.紡織科技進(jìn)展，2007，2：13-18.

［5］陳玲，竺亞斌，李媛媛，等.絲素蛋白在電紡絲法構(gòu)建組織工程支架中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2011，27（6）：831-837.

［6］陳芳芳，閔思佳，朱良均.絲素蛋白材料改性的研究進(jìn)展［J］.絲綢，2005，5（5）：38-41.

［7］Gupta M K，Khokhar S K，Phillips D M，et al.Patterned silk films cast from ionic liquid solubilized fibroin as scaffolds for cell growth［J］.Langmuir，2007，30；23（3）：1315-1319.

［8］Hu K，Lu Q，Cui F Z，et al.Biocompatible fibroin blended films with recombinant human-like collagen for hepatic tissue engineering［J］.J bioact compat polym，2006，21（1）：23-37.

［9］Meinel L，Hofmann S，Karageorgiou V，et al.The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo［J］.Biomaterials，2005，26（2）：147-155.

［10］Liu H，Ge Z，Wang Y，et al.Modification of sericin-free silk fibers for ligament tissue engineering application［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2007，82（1）：129-138.

［11］Lin Z，Willers C，Xu J K，et al.The chondrocyte：biology and clinical application［J］.Tissue Eng，2006，12（7）：1971-1984.

［12］田國忠，閆軍浩，黃紅云等.人骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、純化和鑒定［J］.解剖學(xué)雜志，2010，23（2）：317-320.

［13］黃躍，王旭東，沈國芳，等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)山羊髁突軟骨缺失的綠色熒光蛋白示蹤［J］.中國口腔頜面外科雜志，2007，5（5）：360-364.

［14］Attisano L，Wrana J L.Signal transduction by the TGF-beta superfamily［J］.Science，2002，296（5573）：1646-1647.

［15］Longobardi L，O＇rear L，Aakula S，et al.Effect of IGF-I in the chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells in the presence or absence of TGF-beta signaling［J］.J Bone Miner Res，2006，21（4）：626-636.

［16］Chen X，Xu H，Wan C，et al.Bioreactor expansion of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2006，24（9）：2052-2059.

［17］周廣東，王曉云，劉德莉，等.地塞米松與TGF－β1對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖、分化及代謝的影響［J］.中國實(shí)用美容整形外科雜志，2004，15（1）：51-55.

［18］黃躍，沈國芳，王旭東，等.不同方法誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞用于修復(fù)山羊髁突軟骨缺失的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國口腔頜面外科雜2009，7（6）：534-538.

［19］周廣東，王曉云，劉天一，等.軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)軟骨形成［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志2005，22（3）：272-274.

［20］周廣東，苗春雷，王曉云，等.軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外軟骨形成的實(shí)驗(yàn)研究［J］中華醫(yī)學(xué)雜志2004，84（20）：1716-1720.