細胞生物學“半開放設計性實驗”教學的意義與實施方法

薛雅蓉，劉常宏

（南京大學 生命科學學院，江蘇 南京 210093）

細胞是組成幾乎所有生命有機體（除了病毒）的基本功能單位，要研究生物則避不開細胞。因此，與細胞相關的研究一直是生命科學領域的熱門課題，也是諾貝爾生理學或醫(yī)學獎青睞的研究領域，僅本世紀開始的12年時間里，就有5年頒發(fā)給了細胞生物學研究領域的相關學者。這些研究包括：2002年悉尼·布雷內(nèi)（Sydney Brenner）、羅伯特·霍維茨（H.Robert Horvitz）和約翰·蘇爾斯頓（John E.Sulston）的細胞程序性死亡相關研究；2006年克雷格·梅洛（Craig C.Mello）和安德魯·菲爾（Andrew Fire）的RNA干擾；2009年伊麗莎白 H.布萊克本（Elizabeth H.Blackburn）、卡羅爾 W.葛萊德爾（Carol W.Greider）和杰克 W.卓斯塔克（Jack W.Szostak）的端粒及端粒酶相關研究；2011年基斯·波特（Keith Porter）電子顯微鏡的應用及超薄切片機的發(fā)明；2012年山中伸彌（Shinya Yamanaka）關于誘導多功能干細胞（iPScell）的研究。

由于細胞研究的重要性，開設有生物相關學科（生命科學、醫(yī)學、藥學、農(nóng)學等）的各個高校對于細胞生物學理論及實驗課程都很重視，一般作為本科生的核心必修課程，這也決定了該課程在培養(yǎng)生命科學人才中的重要作用。細胞生物學實驗課程不但要培養(yǎng)學生掌握獨特的細胞生物學實驗方法、原理與技術，還要在實驗過程中提高學生的細胞生物學綜合實驗素質(zhì)與創(chuàng)新實驗能力。要完成這樣艱巨的任務，實驗指導教師在實驗教學中不但應根據(jù)學科發(fā)展對實驗教學內(nèi)容不斷地進行更新，還應不斷探索和改進實驗教學方法。

1 細胞生物學實驗教學方法現(xiàn)狀及存在問題

1.1 常規(guī)教學的作用及問題

截至目前，細胞生物學實驗教學方法主要為常規(guī)實驗教學方法，即由教師提供經(jīng)前人反復驗證、方法可行、結(jié)果可靠的實驗方法，并在實驗前詳細講解實驗背景知識、用途、原理、操作關鍵點及意義、注意事項等。學生被要求完全按照教師的方法進行實驗，然后教師根據(jù)學生實驗結(jié)果及報告等評價、考核學生［1－2］。

常規(guī)教學的作用是：

（1）在每次3～4h的教學時間段內(nèi)能夠完成實驗且得到符合預期的實驗結(jié)果。

（2）能夠規(guī)范學生的實驗操作，培養(yǎng)學生嚴謹認真的實驗態(tài)度。由于學生必須按照教師的方法及操作完成實驗才能得到預期的實驗結(jié)果，就使其認識到，實驗是嚴肅認真的事情，不能馬虎大意，否則就有可能得不到預期結(jié)果。

（3）樹立學生實驗信心。學生只要按實驗步驟正常操作就會得到預期結(jié)果，會給學生樹立起前人能做的自己也可以做的實驗信心。

但常規(guī)教學也有一些不可避免的弊端。由于學生實驗時動手多而動腦少，必然養(yǎng)成依賴于已有方法的習慣，導致學生自主學習積極性下降甚至喪失，懶于思考，繼而思維僵化，嚴重時可能扼殺學生的批判性及創(chuàng)造性思維能力。

1.2 開放設計實驗的意義及實施的困難

為了彌補常規(guī)實驗教學的不足，一些高校的實驗課教師探索在教學實踐中增加開放設計性實驗［3－6］。一般由教師指定選題范圍，然后讓學生選題并設計實驗方法，最后在開放實驗室于正常教學時間之外實施設計實驗［3，5，7］。開放設計實驗項目一般具有4個特征［8］：學生學習的自主性，實驗內(nèi)容的探索性，實驗技能的綜合性，實驗精神的創(chuàng)造性。因此，開展此類實驗能夠克服常規(guī)實驗教學的一些弊端，調(diào)動學生自主學習積極性、提高學生自主學習及運用所學知識分析解決實驗問題的能力及實驗綜合素質(zhì)與創(chuàng)新實驗能力。

然而，完全的開放設計性實驗往往存在實施困難的問題［9］。原因主要有3條：

（1）實驗硬件條件的限制。不同方法要求的實驗條件不同，沒有哪個實驗室具備開展所有方法實驗的條件。比如，細胞融合的方法有電融合法、病毒介導法、PEG介導法。電融合法需要電融合儀，病毒介導法需要繁殖仙臺病毒，不是每個實驗室都可以開展這樣的工作。再比如，檢測細胞增殖能力可用氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）摻入法，也可用 MTT比色法。前一方法用到同位素，國內(nèi)大部分教學實驗室都不具備開展此類實驗的條件。因此，如果讓學生隨意設計實驗方法，有些方法就有可能無法實施。

（2）實驗時間的限制。不同方法實施起來可能需要的時間差別很大。如果學生設計的一些方法需要時間過長，超出正常教學安排太多，就無法在正常教學有限時間內(nèi)進行。比如，如果讓學生設計細胞培養(yǎng)實驗，有的學生會設計植物細胞原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)，那么，由于原生質(zhì)體制備時酶解需要時間較長，就難以在正常實驗時間開設。

（3）實驗教學成本預算的限制。不同實驗方法成本差別很大，對于一些嚴重超出額定預算的方法，就難以開展。

因此，需要尋找一種兼顧教學效果和可行性的實驗教學方法。這種方法既能在一定程度上實現(xiàn)設計實驗的教學效果，又便于在正常教學實驗時間實施且結(jié)果和成本可控。為此，我們提出了“半開放設計性實驗”的概念。下文中，我們將對半開放設計性實驗的內(nèi)涵、實施方法、開展時機等進行論述，并通過2個細胞生物學“半開放設計性實驗”教學實例及學生評價進一步說明該法的具體實施方法及優(yōu)勢。

2 半開放設計性實驗的內(nèi)涵、實施方法及實施時機

2.1 半開放設計性實驗的內(nèi)涵

“半開放設計性實驗”指讓學生在指定的方法內(nèi)進行實驗方法優(yōu)化設計，并能夠在正常實驗教學的限定時間內(nèi)實施的實驗。由于它無論在內(nèi)容選擇方面還是在實施時間方面都有限制，不及一般開放設計實驗的開放程度，因此，我們將其稱為半開放設計性實驗。

2.2 半開放設計性實驗實施方法

實驗前2～3周，教師布置半開放設計性實驗的內(nèi)容及設計要求、實施時間及考核方法，建議學生自由組合成4人小組，以組為單位進行資料查閱與分析、實驗方案討論與確定、實驗準備及實施。實驗前1周，學生應以組為單位開出實驗需要的儀器設備及試劑清單；實驗時學生分工合作，完成所有設計內(nèi)容；實驗結(jié)束后，同組學生共享實驗結(jié)果，并經(jīng)過分析和討論提出實驗結(jié)論，匯總實驗報告。教師通過批閱學生實驗報告對學生設計的合理性及實驗分析進行點評指導。

2.3 半開放設計實驗的開展時機

半開放設計性實驗項目最好安排在學期后期，在學生做過一些精心挑選的細胞生物學代表性、經(jīng)典性實驗，掌握了基本的細胞生物學實驗方法原理和技術，并對理論課內(nèi)容有很好的理解后進行。這樣學生設計實驗方法時對實驗的難度及可行性會有一個比較切合實際的評估，并且對實驗實施需要時間也會有一個較好的掌控。

3 細胞生物學半開放設計實驗實例

3.1 PEG介導的細胞融合實驗

細胞融合（cell fusion）又稱為細胞雜交（cell hybridization），是指2個或2個以上的細胞合并成一個細胞的現(xiàn)象。通過細胞融合可以將2個親本細胞的遺傳物質(zhì)集中在一個后代細胞里，有可能使后代細胞獲得2個親本細胞的優(yōu)良性狀。如單克隆抗體生產(chǎn)中通過細胞融合獲得的雜交瘤細胞，就同時兼?zhèn)湫∈蟪墒霣細胞能夠分泌特定抗體的特性和小鼠骨髓瘤細胞能夠在體外長期存活的特性。直至目前，細胞融合技術在細胞工程領域仍然發(fā)揮著重要作用，除了用于研制生產(chǎn)單克隆抗體外，還用于培育植物新品種，誘導不同種間、屬間，甚至科間原生質(zhì)體的融合。細胞融合有可能打破有性雜交不親和性的界限，廣泛地組合各種基因型，從而形成有性雜交方法所無法獲得的新型雜種植株。

細胞發(fā)生自然融合（骨骼肌細胞形成、精卵結(jié)合）的機會很少，一般需要在特殊誘導條件存在時才會發(fā)生融合。其中一種最為常用的方法就是PEG介導的化學融合法。

PEG即聚乙二醇（polythyleneglycol，PEG），為乙二醇不同分子量的聚合物，可用于誘導動物細胞和植物原生質(zhì)體融合。用PEG介導融合相對于電融合和病毒介導融合的優(yōu)點是材料易得而價廉、操作簡單、效果可靠［10－11］。但是我們在實驗教學實踐中發(fā)現(xiàn)，PEG介導細胞融合的效果常常不如預期，不是融合率太低，就是細胞破壞（凋亡、壞死、甚至脫核）嚴重。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，細胞種類、用于融合的細胞所處狀態(tài)、PEG的分子量、融合液中PEG的濃度、是否添加鈣離子、PEG作用于細胞的時間長短以及去除PEG作用后細胞溫育時間長短，都對最后的觀察結(jié)果有影響。

為了讓學生了解PEG介導細胞融合實驗的復雜性，我們將該實驗作為半開放設計性實驗，讓學生在限定條件下對實驗方法進行優(yōu)化。首先，教師提供給學生足夠的特定細胞材料（雞紅細胞或小鼠腹水瘤細胞）、不同分子量的PEG以及一個常規(guī)實驗方法，要求學生通過查閱、分析資料，了解影響融合效率的其他因素及條件，設計優(yōu)化方案并通過在正常教學時間的實驗找到組內(nèi)相對理想的實驗方法。

經(jīng)過實驗，學生了解到：

（1）不同分子量的PEG溶液在相同濃度時黏度不同，對細胞的作用也不同；

（2）PEG濃度過小不能有效介導細胞融合；

（3）PEG作用時間越長，細胞破壞越嚴重；

（4）將PEG加在細胞懸液中融合效果極差，必須加在離心去掉上清的細胞沉淀中；

（5）鈣離子有促融合作用，但應注意使用濃度與添加方法（避免沉淀產(chǎn)生）；

（6）文獻資料并非都正確，不能照搬于實驗，要多方印證，甄別應用。比如：學生通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，鈣離子有促融合作用，但在具體實驗時卻發(fā)現(xiàn)，多個參考書提供的鈣離子濃度都太大，其溶液無法配制；懷疑單位有誤，后經(jīng)查閱多篇發(fā)表的科研論文求證，證明其確系單位錯誤。再比如，一些細胞實驗指導中融合實驗是將PEG加在細胞懸液中，但經(jīng)證實效果極差，幾乎得不到融合的細胞。

3.2 MTT法檢測細胞活力實驗

MTT即二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽。MTT法是Mosmen于1983年率先建立的一種用線粒體酶活性反映細胞增殖與活力的方法。由于其與通過細胞DNA合成反映細胞增殖活性的3H－TdR摻入法相比，具有無放射危險、操作簡便而快速的優(yōu)點，目前已廣泛應用于細胞生物學、免疫學等學科的研究以及臨床腫瘤細胞的藥敏實驗。

MTT法的檢測原理是：MTT能被各種活細胞（除紅細胞外）攝取，在線粒體內(nèi)被脫氫酶還原，由黃色可溶性溶液轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘淖仙着H（formazan）顆粒沉積在細胞內(nèi)；甲臜的形成量與活細胞數(shù)量及活性成正比，死細胞不形成甲臜。再用細胞裂解液裂解細胞并溶解甲臜后，于波長550～600nm（甲臜有光吸收而MTT無光吸收）測定溶液的吸光值，用以反映細胞的增殖與活力。也就是說，對于同樣活力的細胞，活細胞的數(shù)量越多，測定的可溶性甲臜的吸光值越大，吸光值與細胞數(shù)量成正比。反過來講，只有吸光值與活細胞數(shù)量成正比，才能用吸光值變化反映細胞的增殖活性變化。然而，可溶性甲臜的吸光值并非在任何細胞濃度都與細胞數(shù)量成正比。對于特定細胞而言，只有在一定濃度范圍內(nèi)時，甲臜溶液的吸光值大小才與細胞數(shù)量成正比，影響細胞增殖（促進或抑制）的因素才會引起吸光值的靈敏變化，不同處理的作用才得以有效顯示；若細胞濃度偏離線性檢測范圍，測定結(jié)果就很不規(guī)律，不能反映被檢因素的實際效果。另外，裂解液組成、作用條件與時間等多種因素都會影響甲臜溶液的吸光值測定結(jié)果［12－14］，如果應用不當，則會造成細胞裂解不完全、甲臜溶解不充分而致測定值偏小或不穩(wěn)定（隨時間變化）。

為了讓學生充分了解影響MTT法檢測效果的因素，我們也將該實驗作為半開放設計性實驗。提供給學生小鼠腹腔內(nèi)大量繁殖的S－180細胞（每30人的班只需提供2只接瘤1周的荷瘤小鼠），讓學生從細胞濃度、裂解液及作用條件等方面進行設計，找出MTT檢測值與細胞濃度呈線性關系的細胞濃度范圍以及能夠在正常實驗課時間充分裂解細胞、溶解甲臜（可用倒置顯微鏡監(jiān)測溶解情況）的裂解液及對應裂解條件。

經(jīng)過實驗，學生不僅對上述影響MTT法測定結(jié)果的因素有了充分的認識，還了解到細胞計數(shù)及稀釋準確性、向96孔反應板加細胞前細胞樣品是否充分混勻、操作時是否產(chǎn)生氣泡等對測定結(jié)果的影響。

4 學生對于半開放設計性實驗的評價

學期末，我們要求學生寫一份“細胞生物學實驗總結(jié)、評價與建議”，一方面是為了加強學生對本門實驗課所學內(nèi)容的掌握，另一方面是希望了解學生對該課程本學期教學相關情況的評價以及對今后教學的改進建議。總結(jié)內(nèi)容應包括實驗過的項目內(nèi)容、本人從中學習到的知識及技能、獲得的經(jīng)驗及教訓等。評價及建議主要考慮3個方面：教學內(nèi)容及安排，教學方法，實驗室硬件條件。

從學生總結(jié)中了解到，半開放設計性實驗受到學生的普遍歡迎，他們對于該類實驗的評價是：能夠調(diào)動自主學習積極性；從某種程度上模擬了科研實驗的過程，能夠培養(yǎng)科學思維能力及創(chuàng)新意識；能夠提高利用所學知識及網(wǎng)絡資源分析問題、解決問題的能力；能夠強化團隊協(xié)作意識。因此，學生建議在以后教學中增加這類實驗項目的比例。

5 結(jié)束語

半開放設計性實驗可通過學生對已有方法的改進與靈活運用激發(fā)學生自主學習積極性、提高其實驗綜合素質(zhì)、培養(yǎng)其批判性思維習慣，繼而提高其創(chuàng)新實驗能力。相對于開放設計實驗還具有便于實施、實驗結(jié)果和實驗成本可控、適宜于正常教學時間開展的優(yōu)勢，值得在細胞生物學實驗及其他實驗課教學中推廣。

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