高效液相色譜法檢測(cè)速溶咖啡中的丙烯酰胺

呂昱 嚴(yán)敏 劉禮祥 （貴州民族大學(xué)）

一、引言

隨著國(guó)家不斷的發(fā)展，人民生活水平不斷的提高，咖啡這種“洋貨”早已滲入了普通百姓的日常生活，他口味與真實(shí)咖啡味接近且沖泡方法簡(jiǎn)單，因此速溶咖啡銷(xiāo)售量遠(yuǎn)比傳統(tǒng)咖啡大，但多數(shù)人并不知道的是，速溶咖啡中有一種潛在殺手“丙烯酰胺”。2005年，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布公告：丙烯酰胺是致癌物質(zhì)，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究所提供的資料顯示，速溶咖啡含丙烯酰胺。丙烯酰胺是一種用途廣泛的重要有機(jī)化工原料，是一種中等毒性的親神經(jīng)毒物，可通過(guò)未破損的皮膚、粘膜、肺和消化道進(jìn)入人體，分布于人體液中，丙烯酰胺的神經(jīng)毒性已經(jīng)為許多學(xué)者所公認(rèn)，孫鳳祥等人[8]的研究表明，丙烯酰胺急性中毒后，可使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生炎性水腫，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此嘗試建立高效液相色譜法檢測(cè)速溶咖啡中的丙烯酰胺，為將來(lái)檢測(cè)速溶咖啡中丙烯酰胺的含量提供重要的參數(shù)，對(duì)人類(lèi)健康具有重要的意義。目前食品中丙烯酰胺的測(cè)定方法主要以儀器分析為主，一般的化學(xué)分析不能達(dá)到食品分析的要求。經(jīng)過(guò)一定的萃取、凈化處理后，采用氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC)、質(zhì)譜（MS）及三者聯(lián)用進(jìn)行定性定量檢測(cè)是當(dāng)前通用的檢測(cè)手段，GC-MS聯(lián)用和HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)大大提高了測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度，但對(duì)儀器設(shè)備的要求較高[9]，且GC-MS法需要進(jìn)行衍生化，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣且可能因不定因素導(dǎo)致衍生化失敗。LC/MS/MS雖然具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但儀器價(jià)格和維護(hù)成本過(guò)高，不利于推廣運(yùn)用，HPLC法具有相對(duì)成本低，樣品前處理過(guò)程比較簡(jiǎn)單，分析比較快速、靈敏，準(zhǔn)確度比較高等特點(diǎn)。因此本次研究采用了高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定結(jié)果，配合新型小顆粒ZORBAX Eclipse Plus-C18液相柱，分離效果、速度、靈敏度，準(zhǔn)確度等比較高，基本上滿足了我國(guó)“十一五”國(guó)家重大科技專項(xiàng)“食品安全關(guān)鍵技術(shù)”課題有關(guān)建立食品中丙烯酰胺測(cè)定方法的要求，適用于日常檢測(cè)，可以進(jìn)一步推廣[12]。

二、實(shí)驗(yàn)部分

1、材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

美國(guó)安捷倫公司1260高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器，離心沉淀器，渦旋振蕩器，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司離心機(jī)，GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，超純水制備儀，電子天平，Thermo移液槍。

1.2 材料與試劑

美國(guó)安捷倫公司 ZORBAX Eclipse Plus-C18(4.6×100mm,3.5μm)色譜柱；美國(guó)安捷倫公司AccuBond SPE小柱；純度≥98%丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自貴州迪大生物有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水均為18.25MΩ.cm超純水。

1.3 樣品來(lái)源

速溶咖啡為市場(chǎng)上所購(gòu)多個(gè)品牌樣品，所有樣品均存放于3℃冰箱內(nèi)。

1.4 色譜條件

流動(dòng)相為乙腈：水(v：v,4：96)；流速為 1mL/min；保留時(shí)間為1.50min；測(cè)定波長(zhǎng)為 200nm；柱溫：28℃；進(jìn)樣體積為 20μL。

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1g均質(zhì)化樣品，精確到0.01g，置于10mL具塞玻璃離心管中，用純水定容至刻度，加少量正己烷進(jìn)行去脂處理，于漩渦振蕩器上振蕩10min，然后4000r/min離心10min，吸取下層水相3.0mL到離心管中，在0℃15000r/min高速離心15min，吸取2.0mL下層水相過(guò)柱凈化。SPE凈化：AccuBond SPE(1000mg,6mL)柱用3.5mL甲醇、3.5mL水活化，取2.0mL提取液到SPE柱，用0.5mL水沖洗，用2.0mL水洗脫，收集全部流出液，過(guò)0.45μm濾膜后儲(chǔ)存于3℃冰箱備用。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

將丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品用純水配制成 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按其定好的高效液相色譜條件測(cè)定，在 0.05～0.40μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=423.07X+1.0342，相關(guān)系數(shù)r=0.99959。

2.樣品測(cè)定

測(cè)定了5份不同的市售速溶咖啡和咖啡豆研磨成的咖啡粉，其中2號(hào)為海南春光速溶咖啡，5號(hào)為雀巢速溶咖啡，6號(hào)為咖啡豆研磨成的咖啡粉，其余為不知名品牌咖啡，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，有的咖啡樣品不含丙烯酰胺，有的咖啡樣品含少量丙烯酰胺，從檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看首先咖啡豆所研磨的咖啡粉并不含丙烯酰胺，而海南春光速溶咖啡和雀巢速溶咖啡也未檢出丙烯酰胺，可見(jiàn)這兩種品牌速溶咖啡在加工工藝上處理到位，而其他不知名品牌咖啡則含少量丙烯酰胺。

三、討論

丙烯酰胺在水中的溶解度較大(2155g/L)，水是丙烯酰胺的理想的提取溶劑，用水提取還可以去除速溶咖啡中的大量有機(jī)物。在提取過(guò)程中為避免丙烯酰胺變性，不宜加熱 （溫度不超過(guò)40℃）和超聲提取[11]，而且加熱和超聲波震蕩可產(chǎn)生微小顆粒堵塞固相萃取柱(SPE)，降低凈化效率。對(duì)于富含脂肪的樣品，需要先用正己烷除去脂肪。本次研究發(fā)現(xiàn)，除去脂肪后的樣品或脂肪含量較少的樣品在0℃15000r/min高速離心后，少量脂肪層被固化，可以輕易被去除，簡(jiǎn)化了提取步驟，大大提高了提取效率和消除了干擾。