離子交換分離混合氨基酸實驗方法的改進

黃 毅，袁小紅

(西南科技大學 生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010)

離子交換層析分離混合氨基酸是生物化學或生物制藥工藝學實驗課程中一個重要的制備實驗。從20世紀80年代至今，國內(nèi)高校相關(guān)專業(yè)基本沿用兩套教學體系:第一套以檸檬酸－氫氧化鈉－鹽酸緩沖溶液(控制pH和鈉離子濃度)進行樣品上樣，并以相同溶液進行后續(xù)氨基酸洗脫［1－2］;第二套體系采用檸檬酸緩沖溶液作為平衡液進行樹脂平衡及上樣，而后用氫氧化鈉溶液作為洗脫液進行氨基酸樣品洗脫［3］。兩套體系均使用強陽離子交換樹脂(如732樹脂)。通常用來分離的氨基酸包括賴氨酸、天冬氨酸、組氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸等。第一套方案簡單快捷，但單一緩沖液上樣洗脫模式并未將離子交換技術(shù)的常規(guī)操作步驟融入到實驗中，其原理及實驗操作對該技術(shù)展現(xiàn)不完全，學生在學習過程中所獲知識較少;第二套體系展示了離子交換技術(shù)的基本原理并展現(xiàn)了改變pH進行樣品洗脫這一常規(guī)離子交換分離方案，是較好的教學實驗體系，國內(nèi)很多院校多采用此方案。經(jīng)多年使用，該方案雖然有所衍化提高，但筆者在這幾年的授課中發(fā)現(xiàn)實驗過程中仍然存在諸多問題，比如實驗結(jié)果不穩(wěn)定、結(jié)果解釋不清晰、學生疑問較多及課程設(shè)置存缺陷等問題。通過重新設(shè)計實驗教學授課方案并修改指導手冊，解決了以上問題，提高了教學效果，現(xiàn)與同行分享，希望批評指正。

1 現(xiàn)有實驗方案問題

該實驗一般采用苯乙烯性磺酸鈉型陽離子交換樹脂(001×7，732型)作為分離介質(zhì)，分離的目標混合氨基酸包括酸性氨基酸天冬氨酸(Asp，p I=2.97)，堿性氨基酸賴氨酸(Lys，p I=9.74)以及中性氨基酸丙氨酸(Ala，pI=6.02)等。為簡便實驗過程，常選擇前兩個氨基酸混合組成目標分離溶液。實驗中使用0.5 mol/L，pH=4.5～5.5的檸檬酸緩沖溶液作為平衡液平衡柱子，在樣品上樣后，繼續(xù)以該平衡液沖洗柱子從而以穿透峰形式洗脫出第一個氨基酸Asp。實驗原理是利用4.5～5.5的環(huán)境pH低于Lys的pI值，Lys解離成陽離子形式與樹脂的平衡離子發(fā)生交換而結(jié)合于柱上，而Asp解離成陰離子，不被吸附從而穿透流出層析柱。通過茚三酮反應檢查第一個氨基酸穿透洗脫后，立刻改用pH約為11～13左右的氫氧化鈉溶液作為洗脫液沖洗柱子，此時柱中pH環(huán)境逐步升高并高于Lys的pI，其解離成陰離子狀態(tài)從而無法與樹脂結(jié)合而被洗脫下來。這樣，通過以上兩步操作就將混合氨基酸分離。雖然有部分作者修訂了該方法的部分問題［4］，但實驗中仍可能會遇到如下問題:

1.1 茚三酮反應結(jié)果不穩(wěn)定

因氨基酸無色，要檢查實驗結(jié)果必須用氨基酸茚三酮顯色反應。國內(nèi)權(quán)威生物化學教材已講明茚三酮在弱酸性溶液中與α－氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氨、脫羧，最后茚三酮與反應產(chǎn)物氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成紫色物質(zhì)［5］。根據(jù)以上理論，茚三酮反應必須保證在偏酸性環(huán)境下進行，所以很多實驗教材中都說明在進行該檢測時需在反應體系里面加入少量醋酸或其他緩沖溶液以控制pH值［6］，特別是洗脫第二個氨基酸時所用洗脫液為氫氧化鈉溶液，就更需要將茚三酮反應體系調(diào)到偏酸性，不然反應的結(jié)果不會出現(xiàn)紫色，只會出現(xiàn)淡黃色［7］。而且pH對體系的影響其實不光是顯色，還包括顯色時間等［8］，由于學生個體在實驗中加酸或緩沖溶液及加熱反應時間的差異，會造成反應結(jié)果出現(xiàn)一定偏差，無法較好地進行教學和討論。

1.2 兩個洗脫的氨基酸無法分辨

雖然穿透洗脫和后面的加堿洗脫將兩個氨基酸都分別洗脫分離，但由于顯色體系一樣，結(jié)果都呈現(xiàn)藍紫色，無法表觀分辨到底是哪個氨基酸先洗出哪個后洗出，授課時只能根據(jù)理論解釋第一個是Asp，第二個是Lys。如要證明，必須補加紙層析等其他實驗。顯然這對部分求知欲較強的學生來說，該實驗是不完善的。

1.3 教學設(shè)計存在一定缺陷

該實驗主要是讓學生掌握離子交換技術(shù)的基本理論及實驗操作。理論教學中已經(jīng)說明離子交換樹脂分離化合物是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異來進行物質(zhì)分離的。分離方式包括兩種:一種是通過改變pH值從而改變兩性電解質(zhì)帶電荷狀況，以完成樣品與色譜柱的吸附和解析;另一種是利用質(zhì)量作用定律采用其他高強度離子進行取代分離［9］。以上實驗只應用了第一種分離方式，實際上第二種方式在離子交換技術(shù)中的應用更廣泛、更深入。這樣的實驗設(shè)計缺陷會使學生學習結(jié)束后形成離子交換分離主要依靠pH值控制這一狹隘認識。

2 解決辦法

為解決以上問題，筆者通過文獻檢索及多次實驗研究，對實驗方法進行了如下改進:

1)將常用的強陽離子交換樹脂更換為苯乙烯性季銨型陰離子交換樹脂(201×7，717型)。該樹脂和原732樹脂價格基本無差異，因此不影響實驗預算;

2)在樹脂用酸堿處理結(jié)束并改型后直接置于蒸餾水中浸泡備用。學生裝柱時直接用蒸餾水浸泡的樹脂裝柱，裝柱結(jié)束后無需用檸檬酸緩沖液平衡就可進行樣品上樣，然后直接用蒸餾水洗脫，可得到穿透洗脫的Lys;

3)第一個氨基酸穿透洗脫后，用pH=4.5～5.5的檸檬酸緩沖溶液進行洗脫，可洗脫第二個氨基酸Asp。

該方案的設(shè)計原理是利用蒸餾水pH為中性，在中性環(huán)境下Lys帶正電荷，不能和陰離子樹脂上的平衡離子交換，無法結(jié)合于柱上，直接穿透洗脫;而后在pH=4.5～5.5的檸檬酸緩沖溶液環(huán)境下，雖然Asp仍然帶負電荷，但檸檬酸根是離子強度較強的陰離子，可以利用質(zhì)量作用定律將Asp置換下來。

3 新方案優(yōu)點

1)因樹脂直接在蒸餾水中浸泡，裝柱及穿透洗脫均用蒸餾水，去掉了原有緩沖液平衡一步，減少了前期實驗準備及實驗過程時間。

2)兩次洗脫氨基酸的環(huán)境分別處于中性(蒸餾水)和偏酸性環(huán)境(pH=4.5～5.5檸檬酸緩沖溶液)，因此進行茚三酮顯色反應時不再需要添加乙酸或醋酸緩沖溶液等pH調(diào)節(jié)試劑，這樣就減少了學生實驗中添加酸性緩沖溶液的個體誤差。

3)洗脫氨基酸便于分辨。由于Lys在中性環(huán)境下的茚三酮反應為紫紅色，Asp在偏酸性環(huán)境下的茚三酮反應為藍紫色，對照文獻，學生可明確知道第一個洗脫的是Lys，第二個洗脫的是Asp［10］。

4)授課過程中，學生除了知道了pH值調(diào)整是離子交換技術(shù)一個重要技術(shù)手段外，更清楚質(zhì)量作用定律下離子強度的重要。實驗過程中學生帶著“為什么Asp帶負電荷依然能從陰離子交換樹脂上被洗脫”的問題進行，增加了思考，全面掌握了離子交換技術(shù)的兩種常用洗脫方法。

4 結(jié)束語

在改進后的實驗中實驗器材、上樣量等均無更改，只是更換了樹脂、平衡溶液和洗脫液，減少了平衡液平衡過程及NaOH洗脫液配置。這不只是減少了老師前期準備工作量、時間、學生實驗時間及部分實驗經(jīng)費，還優(yōu)化了實驗的設(shè)計，使學生實驗做得暢快，理論學得更扎實。另外可在實驗課程中分組同時運用新舊兩種方法，使學生體會到書本上的實驗條件、實驗方法并非是固化的，可以根據(jù)所掌握的實驗技術(shù)和理論知識，對實驗條件和實驗方法進行大膽的探索與實踐，從問題中來到問題中去。這樣既有利于啟迪學生的創(chuàng)新思維，又有利于培養(yǎng)學生解決問題的能力，為將來的實際工作打好基礎(chǔ)。修改后的指導書還將該實驗升級，將兩種氨基酸混合液轉(zhuǎn)換為蛋白水解物［11］，與實踐結(jié)合更緊密，增加了實驗難度，可作為學生創(chuàng)新綜合性實驗開出，更好地鍛煉學生的動腦動手能力。實驗［M］.北京:高等教育出版社，1982.

［2］董曉燕.生物化學實驗［M］.2版.北京:化學工業(yè)出版社，2008.

［3］宋方州，何風田.生物化學與分子生物學實驗［M］.北京:科學出版社，2008.

［4］張紅梅，盂新云，官守濤.氨基酸離子交換色譜實驗方法改進［J］.鄖陽醫(yī)學院學報，2006，25(1):42.

［5］王鏡巖.生物化學［M］.3版.北京:高等教育出版社，2000.

［6］陳忠云.α－氨基酸和茚三酮顯色反應機理［J］.教材通訊，1991(2):36－37.

［7］陸珊華，孫愛民.離子交換樹脂層析分離混合氨基酸［J］.南京醫(yī)學院學報，1989，9(4):307.

［8］張振華.α－氨基酸與茚三酮顯色反應影響因素的探討［J］.邵陽高等?？茖W校學報，2000，13(1):42－44.

［9］吳梧桐，高向東.生物制藥工藝學［M］.2版.南京:中國醫(yī)藥科技出版社，2004.

［10］張鑒棠，湯秀玉，韓紅.不同PH對氨基酸與茚三酮呈色反應的影響［J］.南京鐵道醫(yī)學院學報，1992，11(2):126－128.

［11］胡瓊英，狄洌，聶理，等.生物化學實驗［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2007.