大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究

楊其

氟喹諾酮類藥物是一類廣譜、強(qiáng)效的化學(xué)合成藥物，臨床上已廣泛用于各種細(xì)菌性感染。但是隨著這類藥物在臨床的大量應(yīng)用，其耐藥菌株呈蔓延趨勢，嚴(yán)重影響了其臨床療效及應(yīng)用。已知細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物的主要耐藥機(jī)制為:(1)靶位基因Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶即DNA回旋酶基因 (gyrA和gyrB)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅵ基因 (parC和parE)突變;(2)細(xì)菌膜通透性的降低和膜上藥物主動外排泵的激活;(3)質(zhì)粒qnr基因介導(dǎo)細(xì)菌對氟喹諾酮類耐藥。大腸埃希菌的耐藥機(jī)制不斷發(fā)展，造成日益嚴(yán)重的耐藥問題，已成為重要的醫(yī)院感染病原體之一［1］?，F(xiàn)就大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 藥物作用靶位的改變

抗生素的殺菌、抑菌作用是與細(xì)菌不同部位上的靶位蛋白結(jié)合，抑制其功能而生效。而細(xì)菌的耐藥則可以通過不同方式改變靶位蛋白結(jié)構(gòu)，使抗菌藥與其結(jié)合力下降或不能結(jié)合。DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是喹諾酮類藥物的主要作用靶位。

1.1 DNA回旋酶 DNA回旋酶是由2個A亞基和2個B亞基構(gòu)成的四聚體，分別由gyrA和gyrB基因編碼。早在20世紀(jì)80年代通過比較敏感菌和自發(fā)耐藥菌、人工誘變耐藥菌的染色體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了編碼旋轉(zhuǎn)酶的基因突變。gyrA和gyrB基因的突變只限于編碼1個氨基酸的3個堿基中的1個發(fā)生替換。gyrA的突變主要有4個位點，而且集中在較小的區(qū)域，將這一基因區(qū)段稱為氟喹諾酮耐藥決定區(qū) (quinolones resistance determining region，QRDR)，即第199～318個堿基 (Ala67－Gln106)。已證實QRDR的突變與細(xì)菌耐藥有直接關(guān)系［2－3］。只有氨基酸發(fā)生取代的堿基突變才可改變細(xì)菌對藥物的敏感性。近年來研究發(fā)現(xiàn)gyrA的QRDR內(nèi)氨基酸取代方式、位置、取代位點的多少與E.coli耐藥水平有著密切的關(guān)系。尤其是gyrA基因改變最常見，其次是gyrB。gyrB基因突變較為單一，目前發(fā)現(xiàn)氨基酸的替換只有兩個比較集中的位點，即第426和447位，都為單個氨基酸替換。gyrB突變促進(jìn)gyrA突變耐藥性的產(chǎn)生，目前尚無資料表明gyrB突變作為獨立的耐喹諾酮類的機(jī)制。Dela Fuente等［4］研究證實Ser83是gyrA的基本突變點，gyrA基因中密碼子83發(fā)生突變常常造成大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥。同時報道一株大腸埃希菌發(fā)生雙重突變，在密碼子83 Ser to Leu，以及在密碼子87 Asp to Asn。國內(nèi)也有相關(guān)報道gyrA基因突變，除常見氨基酸改變外，還發(fā)現(xiàn)密碼子 87 Asp to Asn、密碼子 84 Ala to Pro［5］。

1.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是由2個C基因和2個E基因組成的四聚體，分別由parC和parE基因編碼。拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅣA亞單位和DNA回旋酶A亞單位在NH2－末端有很高的同源性，即gyrA和parC的N末端均有與喹諾酮耐藥決定區(qū)域QRDR有關(guān)的區(qū)域，在此區(qū)發(fā)生氨基酸的替代影響了喹諾酮類藥物與酶結(jié)合的緊密關(guān)系，從而使其耐藥性增加。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ只是藥物的從屬靶位，DNA回旋酶對氟喹諾酮類藥物比拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ更敏感［6］。蔣萍等［5］通過聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴(kuò)增大腸埃希菌耐藥株的gyrA QRDR區(qū)和parC基因，進(jìn)行PCR SSCP分析;同時，PCR擴(kuò)增marOR基因，在耐藥株中隨機(jī)選取進(jìn)行測序，檢測marOR基因突變情況。發(fā)現(xiàn)gyrA和parC基因突變引起大腸埃希菌產(chǎn)生耐藥，Chenia等［6］報道ParC突變發(fā)生在Ser－80/Glu－84，gyrA基因突變是產(chǎn)生對氟喹諾酮類耐藥的主要原因，parC基因突變可引起菌株對氟喹諾酮類藥物的高水平耐藥。

2 膜通透性屏障及相關(guān)基因突變

大腸埃希菌增加抗生素滲透障礙的主要方式是改變跨膜通道孔蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)，使其與抗生素結(jié)合力下降，以及減少跨膜通道孔蛋白數(shù)量甚至使之消失，從而減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的積聚。大腸埃希菌外膜上存在多種外膜蛋白 (Omp)，主要有OmpA、OmpF、OmpC和OmpK。其中OmpF和 OmpC為大腸桿菌的主要Omp。OmpF和OmpC在大腸桿菌中的表達(dá)以協(xié)調(diào)方式緊密相關(guān)，以保持Omp總量的恒定。當(dāng)細(xì)菌染色體的基因突變引起膜通透性降低影響藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)時，細(xì)菌即可發(fā)生耐藥。在耐氟喹諾酮大腸埃希菌的染色體上已發(fā)現(xiàn)norB、norC、nfxc、nfxB和cfxB等多個染色體突變基因，攜帶這些突變基因的耐藥株幾乎都具有相同的表型Omp的異常，尤其是作為親水性小分子藥物通道的OmpF的減少或缺失，使細(xì)菌對氟喹諾酮類藥物的攝入減少。OmpC通道缺失的菌株對氟喹諾酮類藥物的敏感性似乎不變，提示OmpF減少或缺失是細(xì)菌膜通透性降低的主要因素［7］。OmpF的表達(dá)是通過micF基因調(diào)控的，它編碼一小段反義RNA，與OmpF的mRNA5末端互補(bǔ)，從而阻止OmpF的翻譯過程，最終導(dǎo)致OmpF的蛋白合成量降低［8］。但是Hirai等［9］對大腸埃希菌norC突變株的研究表明，僅由膜通透性降低所引起的藥物蓄積濃度減少極其有限，這提示除OmpF異常外，一定還存在其他引起藥物蓄積濃度降低的決定因素。Chenia等［6］同時還發(fā)現(xiàn)具有粗糙LPS的大腸埃希菌內(nèi)環(huán)丙沙星蓄積量高于具有光滑LPS的菌株，并且與OmpF的表達(dá)無關(guān)。

3 主動外排活躍

主動外排系統(tǒng)是指細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜存在能量依賴性蛋白外排泵，通過主動外排作用將藥物從菌體排出，使達(dá)到作用靶位的藥量明顯減少，不足以發(fā)揮殺菌或抑菌作用。目前發(fā)現(xiàn)與氟喹諾酮類藥物耐藥性有關(guān)的主動外排系統(tǒng)均為多重藥物外排泵。多重藥物外排泵根據(jù)其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用方式及消耗能量的來源不同分為兩類［10－11］:一類是以質(zhì)子驅(qū)動力為能量，以“H藥物”方式向細(xì)胞外作反向轉(zhuǎn)運(yùn);另一類為ABC，以ATP驅(qū)動力為能量，由ATP結(jié)合盒向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)。大腸埃希菌以前者為主，前者按轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子結(jié)構(gòu)、同源性及作用方式又可分為4類:(1)MF(major faciliator family);(2)RND(resistance－nodulation－division family);(3)SMR(small multidrug resistance); (4)MATE(multidrugand toxic compound extrusion)。研究表明，大腸埃希菌與氟喹諾酮類藥物耐藥性有關(guān)的主動外排泵有3個:AcrAB、MdfA和NorE。其中AcrABTolC系統(tǒng)為主要代表，是目前耐藥研究中的熱點，屬于質(zhì)子依賴型，能夠產(chǎn)生對多種抗菌藥的高水平的多重耐藥。AcrAB－TolC系統(tǒng)主要由細(xì)胞內(nèi)膜泵 (AcrB)通過跨膜融合蛋白(AcrA)與外膜的排除泵 (TolC)連接而組成，它有一個寬的底物范圍，主要包括:喹諾酮類、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、青霉素、利福平等多種抗生素，染料和去污劑等。通常情況下AcrAB－TolC系統(tǒng)處于低水平表達(dá)，但在選擇性壓力下會去阻遏出現(xiàn)高表達(dá)。目前研究發(fā)現(xiàn)，藥物分子外排主要和H相偶聯(lián)［12］，它們構(gòu)成一個反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通道開放后，H由于濃度梯度內(nèi)流，藥物分子隨即外排。AcrAB由AcrAB操縱子編碼，而編碼外膜蛋白TolC的基因TolC則位于染色體的其他區(qū)域。AcrAB的表達(dá)受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，MarA、RobA、SoxS是AerAB的正調(diào)控蛋白，可同時增加AcrAB和TolC的表達(dá)。Jellen－Ritter等［13］研究表明AcrR是位于AcrAB基因上游的阻遏蛋白基因，可通過直接增加AcrR數(shù)量阻止AcrAB超表達(dá)，AcrR突變?nèi)プ瓒?，也可使AcrAB表達(dá)增加。同時發(fā)現(xiàn)AcrAB缺失突變體也表現(xiàn)出對氟喹諾酮類藥物耐藥性和多重藥物耐藥表型。另外，MppA對AcrB的轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)節(jié)作用，MppA的無意義突變株中外膜蛋白OmpF的表達(dá)也減少了，可與外排泵產(chǎn)生協(xié)同耐藥。方治平等［14］實驗觀察主動外排泵激活劑 (葡萄糖)和抑制劑 (氰氯苯腙)對氟喹諾酮類藥物在菌體內(nèi)蓄積量的影響，證明主動外排泵對相對親水性氟喹諾酮類藥物的泵出功能明顯強(qiáng)于其對疏水性氟喹諾酮類藥物的作用。

4 質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制

1998年第1個喹諾酮類耐藥質(zhì)粒 (pMG252)在美國阿拉巴馬州的1株臨床分離的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)?？蓪⑧Z酮耐藥性轉(zhuǎn)移至大腸埃希菌、β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素、磺胺類抗菌藥物均耐藥［15］。后來在該質(zhì)粒內(nèi)發(fā)現(xiàn)了喹諾酮耐藥基因qnr，它位于整合子樣結(jié)構(gòu) (與整合子In6和In7同源)qacE△1(季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因)和sull(磺胺耐藥基因)的上游，并被orf 513圍繞。qnr編碼的蛋白qnr屬于五肽重復(fù)家族，與免疫球蛋白McbG有序列同源性，后者通過抑制合成MccB17來保護(hù)DNA解旋酶。qnr具有前后各11個和28個拷貝的五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域，被單一的甘氨酸通過一致的序列A/CD/NI/FxX(其中x為任意氨基酸)隔開。Tran等［16］研究還發(fā)現(xiàn):在酶催化反應(yīng)的早期，也就是促旋酶剛開始與DNA相互作用時，qnr就可能特異地結(jié)合到促旋酶及其相應(yīng)的亞基GyrA和GyrB上，但qnr并不與喹諾酮藥物競爭結(jié)合促旋酶的結(jié)合位點;qnr與促旋酶的相互作用影響了促旋酶的內(nèi)在活性，降低了促旋酶與DNA的結(jié)合，這就意味著喹諾酮作用的全酶－DNA靶位的數(shù)量減少;qnr與促旋酶的結(jié)合，改變了藥物結(jié)合區(qū)域的構(gòu)象，從而降低了藥物識別靶位的效率。Rodríguez－ Martínez等［17］研究證明表達(dá) qnra1 基因的菌株，gyrA和parC基因容易發(fā)生突變，以產(chǎn)生高水平的喹諾酮耐藥性。另外qnr也可能干擾喹諾酮與促旋酶的結(jié)合導(dǎo)致終末復(fù)合體DNA酶藥物的形成減少或qnr可能并不直接影響喹諾酮與促旋酶的結(jié)合，而僅使終末復(fù)合體的穩(wěn)定性降低，從而不能有效地阻止復(fù)制的進(jìn)行和DNA的復(fù)制而耐藥。大腸埃希菌的第二靶位拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ似乎也受qnr蛋白的保護(hù)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)qnr質(zhì)粒很大，為10～50 kbp，同時攜帶多種抗菌藥物耐藥決定簇［18］。迄今為止已鑒定的耐藥決定簇包括:(1)aac基因:編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對氨基糖苷類藥物耐藥。(2)bla基因:編碼FOX－5、DHA－1、OxA－30和SHV－7型內(nèi)酰胺酶，介導(dǎo)對β－內(nèi)酰胺類耐藥。(3)cat基因:編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對氯霉素耐藥。(4)qaeEA1基因:編碼外排泵，排出季銨鹽化合物。(5)sull基因:編碼二氫葉酸合成酶，介導(dǎo)對磺胺類耐藥。多種抗菌藥物耐藥決定簇共存于一種可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，預(yù)示著任一種抗菌藥物耐藥的發(fā)生都可能導(dǎo)致伴隨的其他抗菌藥物耐藥基因的表達(dá)。其中aac基因:編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對氨基糖苷類藥物耐藥。同時大量研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)和染色體介導(dǎo)的耐藥間可能也存在著某種聯(lián)系。Ambrozic Avgustin等［19］研究發(fā)現(xiàn)aac(6')Ibcr基因是低水平PMQR基因，推測它可以增強(qiáng)染色體突變的選擇，并作為臨床耐藥水平的發(fā)生和傳播的原因。qnr基因的單獨存在可使菌株對喹諾酮藥物的敏感性降低，但可能并未達(dá)到具有臨床意義的喹諾酮耐藥水平或僅僅導(dǎo)致低水平的喹諾酮耐藥。但含qnr的菌株在喹諾酮藥物的選擇壓力下容易發(fā)生染色體突變，或者含染色體突變的菌株在適宜的條件下可以捕獲qnr基因，在這兩種情況下菌株同時具有了質(zhì)粒和染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥機(jī)制，引起高水平喹諾酮耐藥。

綜上所述，大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制:藥物作用靶位的改變、膜通透性降低及主動外排活躍、質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，可單獨或協(xié)同作用，使細(xì)菌發(fā)生對氟喹諾酮類藥物耐藥，甚至多重耐藥［20］。因此，我們應(yīng)該合理使用抗感染藥物，研究細(xì)菌耐藥機(jī)制以及抗生素療效評價，尋找和研制有抗菌活性的新抗菌藥物，同時尋找有效的酶抑制劑。

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