中藥提取工藝的實驗設計方案及數(shù)據處理方法

中藥及其復方的提取精制是中藥研究的關鍵技術之一，也是決定其藥效的最根本步驟。該項研究往往要通過實驗設計方案和數(shù)據處理來完成。實驗設計方案和數(shù)據處理方法的選擇直接關系到工藝優(yōu)選結果的可行性及可靠性。本文就中藥提取分離工藝優(yōu)選中常用的統(tǒng)計學方法作一概述，并舉例說明它們在中藥提取工藝中的應用。

1 實驗設計方案

1．1 單因素實驗設計(One－factor experimental design) 單因素實驗設計又稱控制變量法［1］，每次實驗只控制單一變量，而其他因素相對固定。在提取工藝優(yōu)化過程中，常需同時考察多個因素對結果的影響，并對結果進行優(yōu)化。采用固定其他因素改變某一因素的單因素考察法能收到一定效果，但條件優(yōu)選憑經驗，且無法考察各因素間的相互作用。因此，該方法現(xiàn)一般用于預實驗，少有單獨用于提取工藝優(yōu)選的。楊萬政等［2］用單因素實驗法，以綠原酸、牛蒡子苷及總黃酮得率為指標，對溶媒、醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)和浸泡時間等6因素進行考察，優(yōu)選了清喉顆粒的提取工藝。

1．2 正交設計(orthogonal design) 當因素水平數(shù)較多時，需采用實驗次數(shù)較少的實驗設計優(yōu)化法。正交設計是按照正交表和相應的交互表進行的實驗設計，是多因素多水平實驗的效率很高的設計方法。它是由試驗因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進行試驗的，通過對這部分試驗結果的分析了解全面實驗的情況，找出最優(yōu)的水平組合。正交設計保留了析因設計整體考慮、綜合比較的優(yōu)點，避免了析因設計的全面實驗、工作量大的弊?。?］。但必須強調的是，均勻分散和整齊可比是正交設計的本質特征。因此，在應用該方法時，首先應注意所設的因素水平是否均勻分散和整齊可比，否則其后的數(shù)據分析幾乎沒有任何意義?；谶@點，沈群［4］指出“提取次數(shù)”不能作為正交設計的考察因素。

正交設計目前在我國中藥提取工藝研究過程中最為常用。何迅等［5］采用L9(34)正交設計實驗，以大黃素、多糖類、咖啡酸等指標成分的動態(tài)變化為評價指標，對各工藝參數(shù)進行優(yōu)化，篩選了蒲薏顆粒的最佳醇水雙提工藝。傅亮等［6］采用正交設計法研究了四逆泡騰片中干姜油的提取及其β－環(huán)糊精包合的最佳工藝。揮發(fā)油提取工藝考察因素為加水倍量、浸泡時間、蒸餾時間，考察指標為揮發(fā)油提取量。童榮生等［7］通過正交實驗，以小檗堿、巴馬汀、黃芩苷、黃芩素的含量為評價指標，考察了加水量、浸泡時間、煎煮時間對半夏瀉心湯水提醇沉工藝的影響。郝偉偉等［8］采用單因素結合正交設計法，優(yōu)選出65%乙醇溶液為提取溶媒，進一步考察了微波功率、微波輻射時間、乙醇體積分數(shù)及料液比4個因素，用紫外－可見分光光度法測定烏頭總生物堿，采用HPLC法測定芍藥苷，并以其量及浸膏得率作為評價指標，優(yōu)選了微波法提取制川烏配伍白芍中有效成分烏頭總生物堿和芍藥苷的工藝條件。

1．3 均勻設計(uniform design) 均勻設計最早由我國數(shù)學家方開泰和王元在1978年共同提出，它的基本思路就是盡量使實驗點充分均勻分散，使每個實驗點具有更好的代表性，但同時舍棄了正交設計中對因素水平“整齊可比”的要求，以減少試驗次數(shù);然后根據多元統(tǒng)計方法來彌補這一缺陷，使實驗結論同樣可靠。它的突出優(yōu)點是使多因素多水平實驗的次數(shù)大大減少，一般當因素較多且水平數(shù)≥5時，可以考慮均勻設計［3］。

均勻設計首先在我國飛航式導彈的設計中得到有效的應用。近年來，在中藥制劑提取工藝的應用逐漸增多［9］。陳新民等［10］運用均勻設計并結合定量指紋圖技術優(yōu)化了丹黃凝膠醇提工藝參數(shù)。采用HPLC指紋圖譜技術，按U8(82×42)均勻設計考察乙醇體積分數(shù)、乙醇用量、提取次數(shù)和提取時間4個因素，以大黃酚和小檗堿含量、HPLC指紋圖譜特征峰總面積之和以及干浸膏得率為綜合評價指標，采用多元非線性擬合，建立效應指標和考察因素之間的數(shù)學模型，根據最佳數(shù)學模型描繪效應面圖和等高線圖，確定醇提工藝參數(shù)的優(yōu)化范圍及最佳工藝條件。王秀文等［11］采用均勻設計法考察微波功率、提取時間、料液比和提取次數(shù)4個因素對黨參、茯苓混合水溶性多糖含量的影響，優(yōu)選微波法提取的適宜條件。陳麗等［12］采用堿溶酸沉與超聲波相結合的方法提取柿葉總黃酮，并以柿葉總黃酮含量為評價指標，用均勻設計法優(yōu)選提取工藝。艾慶波等［13］為確定超臨界萃取京萬紅的最適宜工藝參數(shù)，通過U12(12×6×6)均勻設計實驗方案，考察壓力、溫度和夾帶劑乙醇濃度的影響，以超臨界提取物的出膏率、β，β－二甲基丙烯酰阿卡寧及異歐前胡素含量為指標，采用多因素分析來確定最適宜工藝參數(shù)。

1．4 星點設計 －效應面法(central composite design－response surface methodology，CCD－RSM) 當因素水平數(shù)較多時，國內常用均勻設計和正交設計進行優(yōu)化，但這兩種方法具有實驗精度不夠，建立的數(shù)學模型預測性較差等缺點。近年來國外常用集數(shù)學和統(tǒng)計學方法于一體的效應面優(yōu)化法(response surface methodology，RSM)進行優(yōu)化［14］，實驗設計采用單因素設計及均勻設計的都有［15，16］，但采用星點設計(central composite design，CCD)的較多。

RSM主要考察自變量對效應的作用并對其進行優(yōu)化。它通過描繪效應對考察因素的效應面，從效應面上選擇較佳的效應區(qū)，從而回推出自變量取值范圍即最佳實驗條件的優(yōu)化法。但必須注意的是，RSM中的自變量必須連續(xù)且可被實驗者準確控制［17］。對于考察因素是非連續(xù)的自變量時，不能使用效應面法進行試驗分析。

CCD設計是多因素五水平的實驗設計，是在二水平析因設計的基礎上加上極值點和中心點構成的。通常實驗表是以代碼的形式編排的，實驗時再轉化為實際操作值，一般水平取值為0，±1，±α，其中0為中值，α 為極值，α =(F)1/4，F(xiàn)為析因設計部分實驗次數(shù)，F(xiàn)=2k(k為因素數(shù))或F=2k×1/2(一般5因素以上采用)CCD［14］。星點設計－效應面法比正交實驗法更簡化，比均勻設計法更全面，其試驗次數(shù)較少，試驗精度高，并適用于多因素、多水平的實驗。該設計法最大的優(yōu)點是可對未做過的實驗進行預測，但同時須有豐富的專業(yè)知識和一定的預實驗來確定各因素的范圍［18］。該方法越來越多被應用于中藥提取工藝優(yōu)選。郜新蓮等［19］采用星點實驗設計法，以丹皮酚產量為指標，以加水量、浸泡時間和蒸餾液體積為考察因素，采用design expert7．05數(shù)據處理系統(tǒng)對牡丹皮中丹皮酚的提取工藝參數(shù)進行了預測分析和優(yōu)化。楊濤等［20］以乙醇濃度、提取時間和溶媒比為自變量，以穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的收率和浸膏得率為因變量，通過對自變量的總評歸一值進行多元線性回歸和二項式擬合，采用星點設計－效應面法優(yōu)化穿心蓮的超聲提取工藝條件。陸剛等［21］通過星點設計－效應面法優(yōu)化酶解參數(shù)，并利用多元線性回歸和多項式回歸建立預測模型，優(yōu)選出丹參須根有效成分的酶法提取工藝。王秋紅等［22］以乙醇體積分數(shù)、提取時間、溶媒比為自變量，以升麻總皂苷得率為因變量，通過對自變量各水平的多元線性回歸及二項式擬合，用效應面法優(yōu)選升麻中總皂苷的提取工藝最佳工藝，同時進行了預測分析。

2 數(shù)據處理方法

2．1 方差分析(analysis of variance，ANOVA) 方差分析由英國統(tǒng)計學家Fisher首創(chuàng)，為紀念Fisher，以F命名，故方差分析又稱F檢驗(F test)［23］。它是在可比較的數(shù)組中，把數(shù)據間的總的“變差”按各指定的變差來源進行分解的一種技術。對變差的度量，采用離差平方和，方差分析方法就是從總離差平方和分解出可追溯到指定來源的部分離差平方和。它能根據數(shù)據分析找出對該事物有顯著影響的因素，各因素之間的交互作用，以及顯著影響因素的最佳水平等。方差分析在中藥提取精制工藝的研究中應用非常廣泛，主要用在正交設計的結果處理中［5－8］。

2．2 回歸分析(regression analysis) 回歸分析所研究的主要問題就是如何利用變量X，Y的觀察值(樣本)，對回歸函數(shù)進行統(tǒng)計推斷，包括對它進行估計及檢驗與它有關的假設等。回歸分析可以理解為用一種確定的函數(shù)關系去近似代替比較復雜的相關關系，這個函數(shù)稱為回歸函數(shù)，在實際問題中稱為經驗公式?；貧w分析在藥學的研究領域有重要的應用價值，其在中藥提取工藝優(yōu)化等方面的正交設計分析、均勻設計分析方法及星點設計－效應面優(yōu)化法的結果處理中均有廣泛的應用［10－22］。王新春等［24］通過正交實驗，用比色法測定有效成分的含量，實驗數(shù)據經不同的計算和分析比較優(yōu)選大黃的提取工藝條件。結果數(shù)據不同的處理方式得到不同的優(yōu)化工藝條件，通過驗證實驗得到可重復的實驗結果。結果表明，用多元線性回歸計算，可彌補正交極差方差計算的不足，更有利于結果解釋和工藝條件的優(yōu)化。

2．3 人工神經網絡(artificial neural network，ANN) 人工神經網絡作為一種聚類分析和模式識別方法，是基于模擬大腦神經網絡結構和功能而建立的一種信息處理系統(tǒng)和理論化的數(shù)學模型，具有能夠進行復雜的邏輯操作和非線性表達能力強大等優(yōu)點。中藥有效成分提取分離是非常復雜的過程，傳統(tǒng)的經驗和方法難于精確反映其多因素多水平的復雜非線性關系，而人工神經網絡是以實驗數(shù)據為基礎，經過有限次迭代計算而獲得的一個反映實驗數(shù)據內在規(guī)律的數(shù)學模型，特別適合于研究復雜非線性系統(tǒng)的特性［25］。劉紅梅等［26］以莪術醇含量為響應指標，用BP神經網絡和遺傳算法優(yōu)化莪術有效成分的超臨界CO2萃取工藝。得出莪術的超臨界CO2最佳萃取工藝，測試樣本的網絡預測值和實際測量值的相對誤差＜4%。優(yōu)化的萃取工藝比常規(guī)最小二乘法的優(yōu)化結果優(yōu)越。楊銘等［27］采用均勻設計法優(yōu)化BP神經網絡模型，并結合遺傳算法獲得了丹參最佳提取工藝，實現(xiàn)了BP神經網絡結合遺傳算法對丹參提取工藝的多目標優(yōu)化。此外，他們還以同樣的方法，優(yōu)化了秦皮的提取工藝［28］。朱俊訪等［29］利用蔥白提取工藝均勻設計試驗結果，建立神經模型，結合遺傳算法對網絡模型進行優(yōu)化，并對實驗數(shù)據進行擬合，結果表明優(yōu)化后的神經網絡具有較高的預測精度。綜上所述，可見每種統(tǒng)計學方法都有其特點和適用范圍，不同的實驗設計方法，其適用的統(tǒng)計指標的計算方法和統(tǒng)計分析方法也會不同。因此，科研工作者應根據實際情況，進行全面的統(tǒng)計學設計，選擇最適合的實驗設計和統(tǒng)計學分析方法，才能使研究結果更科學、更真實可靠。在實際的應用中，常常將各種統(tǒng)計方法聯(lián)合應用，這樣可以更加圓滿地解決問題。隨著統(tǒng)計學、藥學、數(shù)學及應用軟件的快速發(fā)展，統(tǒng)計學在中藥提取工藝研究方面將做出更為突出的貢獻。

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