馬鈴薯種薯脫毒苗快速繁殖技術(shù)及污染防范措施

徐曉麗 李方華

（甘肅省酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系 735000）

馬鈴薯是我國(guó)重要的糧菜兼用作物，在我國(guó)分布廣泛，但生產(chǎn)水平卻相對(duì)較低，平均667m2產(chǎn)量不足1000kg，僅為發(fā)達(dá)國(guó)家平均667m2產(chǎn)量2500kg的1/3。影響產(chǎn)量的一個(gè)重要因素是馬鈴薯病毒，據(jù)了解，馬鈴薯可感染30種病毒。由于生產(chǎn)上是應(yīng)用無(wú)性繁殖，經(jīng)過(guò)多年留種種植后，體內(nèi)病毒的累積使品種植株逐年變小，葉片皺縮卷曲，葉色濃淡不均，莖稈矮小細(xì)弱，塊莖變形龜裂，產(chǎn)量逐年下降，對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。由于馬鈴薯育種體系尚不健全，農(nóng)民自留種現(xiàn)象普遍，生產(chǎn)上大約80%以上馬鈴薯感染病毒。目前，采用馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)是解決馬鈴薯種性退化最有效的方法之一，這一技術(shù)具有周期短、效率高、能與組織培養(yǎng)快速繁殖相結(jié)合等特點(diǎn)，在馬鈴薯生產(chǎn)上普遍應(yīng)用。

1 脫毒苗的快速繁殖

1.1 培養(yǎng)基制備

冬季采用MS加赤霉素 （0.25mg/L）加奈乙酸（0.01mg/L）加 6-芐基氨基嘌呤（0.5mg/L）加泛酸鈣（2g/L）加白糖3%加瓊脂0.7%，用1moL/LHCI或1moL/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0（夏季6-芐基氨基嘌呤的量減至0.1mg/L）。

1.2 滅菌

配好的培養(yǎng)基按每瓶25～30mL分裝于培養(yǎng)瓶中，用透氣薄膜封口，旋上瓶蓋，置于121℃、壓力114g/cm的容器中高壓蒸汽滅菌20min，并置于無(wú)菌室內(nèi)待用。

1.3 無(wú)菌接種

在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用鑷子夾出經(jīng)病毒檢測(cè)合格的試管小植株，按節(jié)切段，每段帶1片小葉，然后扦插到經(jīng)滅菌后的培養(yǎng)基中，每瓶扦插8～12節(jié)莖段。接種完畢后，瓶口置于火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)灼燒消毒，蓋上封口膜，用橡膠圈扎緊，標(biāo)記上品種名稱和接種日期。

1.4 無(wú)毒苗培養(yǎng)

在溫度24～26℃、日照時(shí)間12～14h/d、光照度2000～2500Lx條件下培養(yǎng)，待小苗長(zhǎng)至10cm左右時(shí)，可進(jìn)行下一輪快繁轉(zhuǎn)接。

2 馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的污染問(wèn)題

2.1 真菌污染

（1）培養(yǎng)基表面存在大量真菌污染：培養(yǎng)瓶瓶口封得不嚴(yán)或培養(yǎng)基存放環(huán)境真菌孢子濃度過(guò)大。（2）培養(yǎng)基內(nèi)部存在大量真菌污染：母液儲(chǔ)備液被污染。（3）接種室內(nèi)真菌孢子濃度過(guò)大或超凈工作臺(tái)的濾網(wǎng)不干凈：種后培養(yǎng)基表面存在真菌污染而且位置不定。（4）接種到培養(yǎng)基以后，在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)外植體周圍出現(xiàn)真菌污染：外植體材料本身帶有菌。（5）培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)污染的真菌是零星地分散在培養(yǎng)基中：人為因素造成的，如培養(yǎng)基和接種器具滅菌不徹底、超凈工作臺(tái)長(zhǎng)時(shí)間不更換濾膜、操作不規(guī)范等。

2.2 外植體滅菌不徹底

在室外采集回來(lái)的材料，由于生長(zhǎng)環(huán)境不干凈帶有很多雜菌，如果滅菌處理方法不當(dāng)，導(dǎo)致滅菌不徹底，在接種培養(yǎng)2～3d后外植體周圍長(zhǎng)滿細(xì)菌或真菌，或者兩種菌都有。這樣不但得不到預(yù)想中的結(jié)果，同時(shí)還會(huì)因?yàn)閹Ь绊懪囵B(yǎng)室內(nèi)的其他培養(yǎng)材料，造成交叉感染。

3 防范措施

3.1 消滅污染源

應(yīng)定期清理消毒接種室和培養(yǎng)室，保持環(huán)境高度清潔，保證所用容器潔凈，接種室要經(jīng)常用紫外線燈消毒滅菌，對(duì)已經(jīng)被真菌污染的材料要經(jīng)過(guò)高壓滅菌后扔掉，即使僅形成菌絲也應(yīng)處理后扔掉。遇到內(nèi)生菌污染可通過(guò)在培養(yǎng)基中添加一些抑菌劑或抗生素如青霉素、鏈霉素等來(lái)防止和減少內(nèi)生菌的污染。在馬鈴薯核心種苗的擴(kuò)繁接種過(guò)程中，特別是在轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)所要轉(zhuǎn)接的馬鈴薯材料一定要在燈光下仔細(xì)觀察，確認(rèn)材料無(wú)污染。

3.2 用正確的滅菌方法進(jìn)行滅菌

對(duì)馬鈴薯基礎(chǔ)材料或誘導(dǎo)所得的芽，要先在水龍頭下沖洗干凈，同時(shí)拿柔軟的毛刷輕刷表面，最后在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理，一般可用10%次氯酸鈉溶液或0.1%升汞溶液進(jìn)行滅菌。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中采用復(fù)合滅菌劑處理比使用單一滅菌劑處理滅菌效果更好。因此，在馬鈴薯組織培養(yǎng)過(guò)程中，為了增強(qiáng)滅菌效果，可采用混合消毒液或進(jìn)行多次消毒，即用10%次氯酸鈉溶液滅菌處理2～3min，再用0.1%升汞溶液滅菌處理2～3min，這樣可取得很好的滅菌效果。工作人員在進(jìn)行接種前要換工作服并帶口罩，并用75%酒精仔細(xì)擦手，方可進(jìn)行下一步工作。同時(shí)，工作人員在接種過(guò)程中要嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求進(jìn)行材料轉(zhuǎn)接，盡量少走動(dòng)、不說(shuō)話，以減少空氣震動(dòng)和流動(dòng)，減少污染。

3.3 嚴(yán)格接種后的管理

在材料的培養(yǎng)階段，應(yīng)定期清理消毒培養(yǎng)室，保持培養(yǎng)室內(nèi)空氣潔凈。定期用甲醛溶液、米醋或臭氧機(jī)熏蒸培養(yǎng)室，非工作人員應(yīng)盡量少進(jìn)入培養(yǎng)室內(nèi)。一旦發(fā)現(xiàn)污染要及時(shí)處理，若為真菌污染，必須對(duì)污染的苗用高壓鍋滅菌后銷毀；若為細(xì)菌污染，而且被污染的材料是比較稀少且珍貴的，可以對(duì)所污染的材料進(jìn)行挽救。具體做法：將被污染的整瓶材料拿出培養(yǎng)室，用酒精棉蓋住污染處，剪下植株頂部再次進(jìn)行滅菌處理后轉(zhuǎn)接到干凈的培養(yǎng)基中。

馬鈴薯脫毒效率直接影響到馬鈴薯原原種的質(zhì)量，如果采取合適的手段提高脫毒效果，馬鈴薯原原種的質(zhì)量會(huì)明顯提高，所以莖尖培養(yǎng)脫毒育種是一種很有潛力的方法。