羊水干細(xì)胞對(duì)梗死心肌的修復(fù)作用

何凌宇，項(xiàng) 軍，梅 健，王 巖，王 磊，劉 成，薛 松

心肌發(fā)生缺血性梗死后，心肌細(xì)胞隨之出現(xiàn)壞死、凋亡等病理改變，造成有效細(xì)胞數(shù)目減少，由于成熟的心肌細(xì)胞本身已不再具有再生修復(fù)的能力，那么損傷及壞死的心肌細(xì)胞逐漸形成了纖維瘢痕，這樣的心室重塑只有導(dǎo)致有效的心室功能下降的趨勢(shì)，促使心力衰竭盡快發(fā)生［1］。近年隨著科技的進(jìn)步，在心血管修復(fù)的再生治療學(xué)領(lǐng)域里有了突破性進(jìn)展，心肌細(xì)胞成形術(shù)(cellular cardiomyoplasty，CCM)可以通過(guò)干細(xì)胞、祖細(xì)胞或心肌細(xì)胞移植，或者通過(guò)動(dòng)員外周血或骨髓干細(xì)胞，重植于心肌損傷的部位，從而對(duì)梗死心肌進(jìn)行再生修復(fù)［2－3］。CCM 成為有可能逆轉(zhuǎn)心肌梗死后惡化的血流動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)內(nèi)分泌的利器。各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證明了干細(xì)胞具有可再生心肌細(xì)胞、改善梗死心肌的血液灌注和心臟功能的生物學(xué)效應(yīng)［4］。

目前，CCM 應(yīng)用于臨床的主要有胚胎干細(xì)胞(ESCs)、骨髓來(lái)源的干細(xì)胞/祖細(xì)胞、脂肪組織來(lái)源的多潛能干細(xì)胞、宿主心肌干細(xì)胞(resident cardiac stem cells，CSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞群 (Mesenchymal stem cells，MSCs)。而羊水干細(xì)胞(Amniotic fluid stem cell，AFS)由于組織來(lái)源廣泛、分離純化方法簡(jiǎn)單易行、體外培養(yǎng)具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，使其作為細(xì)胞心肌移植的良好供體，顯示出其巨大的潛力。

1 羊水來(lái)源干細(xì)胞是可靠的修復(fù)細(xì)胞來(lái)源

羊水中細(xì)胞成分眾多，目前對(duì)于這些細(xì)胞的起源了解有限，羊水中除有胎兒的表皮細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞、消化道和泌尿道等體腔管道的脫落細(xì)胞外，還含有來(lái)源于羊膜組織和3個(gè)胚層的細(xì)胞［5］。對(duì)孕期在7 ～12 周的羊水細(xì)胞組成分析，發(fā)現(xiàn)羊水中含有可能來(lái)源于胚胎卵黃囊的造血祖細(xì)胞，也是組織修復(fù)細(xì)胞之一。

Kocher 等［6］對(duì)人羊水細(xì)胞進(jìn)行了分析，結(jié)合Kazuki 等［7］在人和鼠的AFS 中研究結(jié)果，分離出羊水中表達(dá)Esc 和Asc 表面標(biāo)志的細(xì)胞，并以此估計(jì)AFS 數(shù)量上約占羊水細(xì)胞總數(shù)的1%。他們認(rèn)為這種干細(xì)胞多潛能性介于胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞之間。

2 AFS 生物學(xué)特性

2.1 AFS 的標(biāo)志性抗原 目前尚未發(fā)現(xiàn)人AFS 所特有的表面標(biāo)志性抗原，但對(duì)人AFS 的表面標(biāo)志的鑒定，基本取得了共識(shí)，AFS 表面表達(dá)CD29、CD44、CD105、CD73 黏附因子和間充質(zhì)的標(biāo)志，不表達(dá)CD34、CD45 等造血干祖細(xì)胞標(biāo)志及內(nèi)皮標(biāo)志Cn31，胚胎性抗原中SSEA－4、Oet－4 陽(yáng)性，而SSEA －3、Tra－l－61、Tra －l －80 為陰性。人類白細(xì)胞抗原HLA －DR 陰性，而Ⅰ類白細(xì)胞抗原HLA－A、B、C 陽(yáng)性。但是各個(gè)研究組對(duì)這些標(biāo)志性抗原所測(cè)定的數(shù)量差異較大，造成這種現(xiàn)象的原因可能是缺乏統(tǒng)一的AFS 的純化標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)方法的差異性等各個(gè)方面造成，同時(shí)這也表明羊水中可能存在表達(dá)抗原差異的干細(xì)胞群的存在［8］。

特別是Oct－4、Nanog、SSEA －4 等胚胎特異性標(biāo)志抗原的表達(dá)，Oct－4、Nanog 是維持干細(xì)胞分化潛能的主要轉(zhuǎn)錄因子，干細(xì)胞分化后該基因的表達(dá)馬上下調(diào)或消失，這在最近對(duì)再生修復(fù)基因重組方面的研究中得到明確。特異性抗原SsEA－3/ssEA－4 抗原來(lái)自小鼠移植前胚胎及人類胚胎細(xì)胞，而且這些表達(dá)僅限于移植前的胚胎細(xì)胞表面［9］。因此可以說(shuō)明，AFS 可能來(lái)源于非常原始的細(xì)胞群落，比成體干細(xì)胞具有更廣泛的自我更新和多種系分化的能力。

2.2 AFS 的多向分化能力 2011 年Li 等［10］最早報(bào)道了從人孕早期羊水中分離并擴(kuò)增的干細(xì)胞，于體外將其誘導(dǎo)為脂肪樣細(xì)胞及成骨樣細(xì)胞，隨后AFS 向神經(jīng)元、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等誘導(dǎo)的報(bào)道不斷出現(xiàn)，誘導(dǎo)體系與其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞相似度較高。Muller等［11］從孕4 ～6 個(gè)月人的羊水中分離培養(yǎng)獲得的多能間充質(zhì)干細(xì)胞，在誘導(dǎo)因子作用下能夠向多種細(xì)胞分化，這些包含了:使用地塞米松、胰島素等誘導(dǎo)其分化為脂肪細(xì)胞;使用地塞米松、維生素C－2 －磷酸鹽可以誘導(dǎo)其分化為成骨細(xì)胞;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和p －琉基乙醇等誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)系細(xì)胞，之后并證實(shí)了分化后的神經(jīng)系細(xì)胞能夠分泌釋放多巴胺。Zhao等［12］對(duì)羊水成纖維細(xì)胞型細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，于第3 代獲得與BMSCs 相似，形態(tài)學(xué)上同源于成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞群。

在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，AFS 分化至第8 代可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、多形態(tài)軟骨細(xì)胞和神經(jīng)元;第5 ～21 代，由于細(xì)胞端粒酶活性水平的不斷降低，成骨蛋白、甲胎蛋白、Nestin和肝細(xì)胞核因子在體外擴(kuò)增時(shí)顯示出差異性表達(dá)是比較明顯的。有關(guān)AFS 的分化潛能，有幾個(gè)值得注意的現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)學(xué)者馬曉榮等［13］發(fā)現(xiàn)人羊水來(lái)源干細(xì)胞以類胚體樣結(jié)構(gòu)形式向心肌樣細(xì)胞分化的可行性，為AFS 在再生醫(yī)學(xué)的研究做出了較大貢獻(xiàn)。

3 AFS 在組織工程學(xué)的廣泛應(yīng)用

羊水來(lái)源的干細(xì)胞為組織工程提供了一個(gè)新的種子細(xì)胞來(lái)源。Orlic 等［14］將體外培養(yǎng)獲得的羊水細(xì)胞處理后，種植于可降解的生物材料PGA 支架上，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，密集度的增加，逐漸能填滿PGA 纖維孔隙。羊水來(lái)源的胎羊間充質(zhì)干細(xì)胞也被成功地應(yīng)用于構(gòu)建組織工程，隔肌進(jìn)而修復(fù)新生的隔肌，并取得了良好的效果。Wang 等［15］將AFS 處理后嵌入藻酸鹽做支架的工程上，此細(xì)胞/支架結(jié)構(gòu)在骨原性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后植入免疫缺陷鼠皮下后成功形成組織工程骨組織。AFS 在醫(yī)學(xué)多學(xué)科再生方向中取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。

2010 年Valli 等［16］研究中將羊水來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，處理后能夠移植入正常鼠大腦的多個(gè)區(qū)域并長(zhǎng)期保持存活，而且發(fā)現(xiàn)在注入腦缺血的模型鼠的腦缺血區(qū)外圍時(shí)具有向損傷區(qū)域分化、遷移的能力。AFS 分化后的細(xì)胞也能夠表現(xiàn)出特定的再生功能，神經(jīng)元可分泌各種神經(jīng)遞質(zhì)樣物質(zhì)，分化的肝細(xì)胞可產(chǎn)生尿素樣物質(zhì)，將標(biāo)記綠色熒光蛋白的AFS 通過(guò)顯微注射技術(shù)注射到孕12d 左右小鼠胚胎腎臟皮質(zhì)內(nèi)，通過(guò)活體顯微觀察，原為雜交等技術(shù)證實(shí)注射的AFS 可整合到原始腎臟細(xì)胞群體中并進(jìn)一步分化、生長(zhǎng)［17－22］。

4 展望

干細(xì)胞研究是21 世紀(jì)再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，AFS 可為組織工程學(xué)研究提供新的種子細(xì)胞來(lái)源，隨著深入研究AFS的分化機(jī)制及實(shí)驗(yàn)方向的開展，建立和完善AFS 的體外培養(yǎng)體系，對(duì)梗死心肌的再生醫(yī)學(xué)研究具有重大意義。

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