菟絲子醇提液對(duì)大鼠離體心缺血再灌注損傷保護(hù)作用

于拔萃，曹國(guó)珍，田卉，王振華，鄭秋生

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院／新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002；2蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000）

缺血／再灌注損傷（ischemic reperfusion injury，IRI）是臨床上一種較為常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，是指組織、器官供血中斷，一定時(shí)間內(nèi)再恢復(fù)血供，原缺血組織、器官不僅功能沒(méi)有恢復(fù)，反而使功能障和結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)、溶栓等各種治療缺血性心臟病方法的廣泛開(kāi)展，心肌IRI也越來(lái)越常見(jiàn)，表現(xiàn)為再灌注后缺血的心肌出現(xiàn)舒縮功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的變化及血管無(wú)復(fù)流等現(xiàn)象。缺血／再灌注（ischemic／reperfusion，I／R）的機(jī)制至今仍未完全闡明，目前認(rèn)為能量代謝障礙［1］是I／R損傷發(fā)生的基礎(chǔ)，自由基的大量產(chǎn)生［2］、細(xì)胞內(nèi)鈣超載［3］、心肌細(xì)胞凋亡［4］、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［5］等在心臟I／R過(guò)程中起著重要作用。

菟絲子為旋花科一年生寄生性蔓草菟絲子（CuscudachinensisLam．）的成熟種子，是常用的補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)肝腎、益精明目、固精縮尿、止瀉安胎的功效，其有效成分主要包括黃酮類、多糖類、生物堿類等物質(zhì)，目前研究表明黃酮類可能為菟絲子的主要有效成分［6－7］。菟絲子黃酮類化合物具有清除氧自由基［8］、擴(kuò)張血管、改善腦循環(huán)的作用，對(duì)心血管具有一定活性，能夠減慢心律、降低血壓、增加冠狀動(dòng)脈流量、降低心肌耗氧量和改善微循環(huán)等［9－10］。

本實(shí)驗(yàn)采用離體大鼠心肌缺血再灌注模型，研究菟絲子提取液對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物：成熟 Wister大鼠30只，雄性，體重300～400g，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)：SCXK（新）2011－0004。

1．2 試劑

Langendorff恒流循環(huán)離體灌流系統(tǒng)（Radnoti，美國(guó)）；4SAD Instruments多道生理儀（澳大利亞Powerlab）；3001－1064多功能酶標(biāo)儀（Thermo電子科技公司）；TGL 16M離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；SOD試劑盒和MDA試劑盒，購(gòu)于南京建程生物技術(shù)前限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．3 方法

1．3．1 菟絲子醇提液的制備

稱取20g菟絲子粉末置于燒杯中，加入70%乙醇600mL，浸泡12h，提取溫度40℃下超聲提取40min，過(guò)濾；濾渣再次加入70%乙醇600mL，浸泡12h，40℃下超聲提取40min，過(guò)濾；將兩次濾液合并，減壓蒸餾揮去乙醇，濃縮至最終濃度為2．5×103g／L（按含有生藥量）。

在該條件下測(cè)得菟絲子總黃酮的含量為3．46%的提取液［11］。

1．3．2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分組如下：

1）正常組：以K－H液平衡灌流95min；

2）模型組：以K－H液平衡灌流30min，停灌20 min，再灌45min；

3）菟絲子醇提液組：以K－H液平衡灌流20min，改用含12．5g／L的菟絲子醇提液的K－H液灌流10 min，之后停灌20min，K－H液再灌45min。

以生理記錄儀記錄灌流全過(guò)程心臟功能變化情況，以軟件自動(dòng)分析再灌注2、15、30和45min時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)情況以反映心功能狀況，以缺血前10min數(shù)值為基礎(chǔ)值100%，再灌注期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以缺血前心功能百分率表示。

1．3．3 離體心臟缺血再灌注模型

方法參照文獻(xiàn)［12］所述并稍作改良。具體如下：

取大鼠稱重，60mmol／L 的水合氯醛（0．35g／kg，ip）腹腔注射麻醉。仰臥固定，迅速開(kāi)胸取出心臟（連帶較短的主動(dòng)脈血管），置于95%O2與5%CO2混合氣體充分飽和4℃的K－H液中，輕柔擠壓，排出淤血，然后將心臟固定于Langendoff裝置上，用95%O2和5%CO2混合氣體充分飽和的37℃的K－H緩沖液恒壓逆行灌流。剪開(kāi)左心耳，球囊從左心耳開(kāi)口處插入左心室，球囊內(nèi)壓調(diào)至6～9 mmHg。

球囊導(dǎo)管連接壓力換能器，與4導(dǎo)聯(lián)多功能生物記錄儀（AD Instruments）相連，連續(xù)記錄如下指標(biāo)：心率（HR）、左心室舒張壓 （LVEDP）、左心室收縮壓（LVSP）、計(jì)算左心室發(fā)展壓 （LVDP，LVDP＝LVSP－LVEDP），Chart 5記錄軟件自動(dòng)分析左心室壓力最大升高速率（＋dp／dtmax）以及左心室壓力最大下降速率（－dp／dtmin）以計(jì)滴器實(shí)時(shí)記錄冠脈流量（CF）。

1．3．4 心肌組織SOD活性、MDA含量測(cè)定

心臟灌流結(jié)束后，切取0．5g左心室組織，置于勻漿器中，用冰生理鹽水按1∶9（W／V）比例制備成心肌組織勻漿，10500r／min，4℃離心10min取上清液，嚴(yán)格按試劑盒方法測(cè)定。放入－20℃冰箱中保存，待測(cè)。

1．3．5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉX±S表示，采用SPSS10．0軟件，以單因素方差分析進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P＜0．05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2．1 菟絲子醇提液對(duì)離體大鼠心臟缺血再灌注損傷后功能恢復(fù)的影響

心臟缺血前左心室發(fā)展壓LVDP（圖1）、心室收縮最大速率（＋dp／dtmax）（圖2）、心室舒張最大速率（－dp／dtmin）（圖3）均沒(méi)有顯著性的差別。缺血再灌注后，心肌舒縮功能明顯下降（P＜0．01）。與模型組比較，菟絲子醇提液預(yù)處理可促進(jìn)心肌舒縮功能的恢復(fù)，與模型組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。control為正常組，I／R 為缺血再灌注組，CCLE為菟絲子提取液組，I／R與control相比，＊＊P＜0．01；CCLE與I／R相比，##P＜0．01（n＝6）。＊＊P＜0．01。

2．2 對(duì)心率（HR）的恢復(fù)作用

菟絲子提取液對(duì)大鼠離體心缺血再灌注心率（HR）的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知：心臟缺血前HR無(wú)明顯差異．在缺血再灌注剛開(kāi)始很短的時(shí)間內(nèi)，心臟HR明顯降低，但隨著再灌注時(shí)間的變化，心臟心率有較好的恢復(fù)，總體仍低于缺血前。與正常組比較，I／R組HR明顯降低（P＜0．05），具有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但菟絲子醇提液預(yù)處理組較I／R組HR無(wú)明顯的改善。

2．3 對(duì)心臟冠脈流量（CF）的改善作用

菟絲子提取液組對(duì)大鼠離體心缺血再灌注冠脈流量（CF）的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知：心臟缺血前CF無(wú)明顯差異。再灌后與正常組比較，I／R組CF略有降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組相比，菟絲子醇提液預(yù)處理組的CF無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．4 菟絲子醇提液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠離體心臟SOD、MDA的影響

從表3數(shù)據(jù)可知，I／R組與正常組相比，其心肌SOD酶活力顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0．01）；菟絲子醇提液組與正常組相比心肌SOD酶活力仍明顯下降，但同I／R組相比顯著升高（P＜0．01）；菟絲子提取液組與正常組相比心肌MDA含量讓處在較高水平，但同I／R組相比顯著降低（P＜0．05）。

3 討論

菟絲子的化學(xué)成分主要包括香豆精、黃酮、甾醇類、多糖等［6］。研究表明無(wú)論是醇提物或是水提物對(duì)心血管系統(tǒng)都有一定作用，包括減輕實(shí)驗(yàn)性心肌缺血的程度和范圍，有效改善心臟血流動(dòng)力學(xué)，增加冠脈流量，降低心肌耗氧量等［13－16］。心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌可逆性或不可逆性損傷均造成心肌舒縮功能降低，表現(xiàn)為持久的心輸出量減少，心室內(nèi)壓量大變化速率降低，再灌溉性心律失常、心肌內(nèi)酶的外漏和冠脈流量減少［17］。本研究表明，缺血再灌注后LVDP、＋dp／dtmax和－dp／dtmin均下降，HR 減慢，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［18］。CCLE能顯著改善LVDP、＋dp／dtmax和－dp／dtmin恢復(fù)率（P＜0．01），HR和CF的恢復(fù)率也有所提高。結(jié)果顯示菟絲子醇提物對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

菟絲子醇提液的生物學(xué)作用主要與其黃酮類化合物有關(guān)，如槲皮素、紫云英甙、金絲桃甙等［6］。最近研究顯示，菟絲子提取物均具有一定的體外抗氧化活性［19］。菟絲子提取物同樣能減少大鼠腦組織、小鼠肝臟及神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷［20－22］。大量的實(shí)驗(yàn)研究證明：在缺血再灌注過(guò)程中，大量自由基生成，自由基對(duì)細(xì)胞的主要損傷是能夠引起構(gòu)成生物膜的不飽和脂肪配發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使細(xì)胞的膜功能遭到破壞。MDA是生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化間接反應(yīng)了組織中自由基含量及肌體內(nèi)環(huán)境中氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD是體內(nèi)抗氧化物酶系統(tǒng)成員之一，其活性能反映生成過(guò)氧化氫，后者過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px）的作用下轉(zhuǎn)變成水，從而減少自由基在體內(nèi)蓄積，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，維護(hù)組織細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能［23］。本研究表明，心肌組織中SOD活力明顯增高，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量降低。由此可見(jiàn)CCLE可以抑制缺血再灌注所致的氧化脅迫損傷，同時(shí)降低脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕心肌氧化損傷。

綜上所述，CCLE具有明顯抗離體心腦缺血再灌注操作的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)提高心肌細(xì)胞清除自由基能力而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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