食管癌Eca109單克隆細(xì)胞株的干細(xì)胞特性研究

趙生霞，黃燕燕，慕曉玲

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

食管癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤之一，由于早期確診率低，即使手術(shù)切除，預(yù)后仍較差，易復(fù)發(fā)，全世界每年約有30萬人死于此類疾?。?］。目前針對(duì)食管癌的研究還處于止步不前的現(xiàn)狀。Mackilop等［2］提出的腫瘤干細(xì)胞理論，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中存在不同的細(xì)胞亞群，只有少數(shù)的細(xì)胞亞群具有類似干細(xì)胞的特性，在腫瘤形成、生長、浸潤、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。因此，分離、篩選出增殖和侵襲能力均較強(qiáng)的細(xì)胞，將對(duì)發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞及指導(dǎo)腫瘤臨床治療具有重要的意義。

本課題組許健等［3］發(fā)現(xiàn)食管癌TE－1細(xì)胞中存在P75NTR、Oct－4表達(dá)定位不同的情況，三氧化二砷誘導(dǎo)后核表達(dá)陽性的細(xì)胞相對(duì)增多，推測P75NTR、Oct－4核表達(dá)陽性的食管癌細(xì)胞可能為食管癌干細(xì)胞。

本文將繼續(xù)從細(xì)胞形態(tài)、腫瘤相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)及干細(xì)胞相關(guān)特性等方面對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1．1 材料

食管癌Eca109細(xì)胞株購自中國上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

高糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司）；胎牛血清（Gibco公司）；兔抗人P75NTR多克隆抗體（Millipore公司），兔抗人 Oct－4多克隆抗體（Cell signal，2750#），山羊抗兔IgG－FITC二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）及胰酶（美國Sigma公司）；LSM－510激光共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；24孔Tanswell小室（millipore公司）；1．2μm孔徑 Matrigel Matrix基質(zhì)膠（BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 Eca109細(xì)胞單克隆培養(yǎng)及HE染色

當(dāng)Eca109細(xì)胞生長密度大于80%時(shí)，用0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化，加入高糖DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，將其稀釋成為3～5個(gè)細(xì)胞／mL的細(xì)胞濃度。加入明膠包被的96孔板中，每孔0．1mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)6～12h。待細(xì)胞下沉并貼于培養(yǎng)孔底后，置相差倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)記含1個(gè)細(xì)胞的孔。

繼續(xù)培養(yǎng)1～2周，待被標(biāo)記孔內(nèi)細(xì)胞生長至50個(gè)細(xì)胞，選擇生長良好的圓形克隆團(tuán)傳至48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，依次傳至24、12、6孔板，最后傳至培養(yǎng)瓶，達(dá)到實(shí)驗(yàn)需要細(xì)胞量。取對(duì)數(shù)生長期的Eca109單克隆細(xì)胞株分別接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞生長至密度大于80%左右，行常規(guī)HE染色。

1．2．2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測P75NTR、Oct－4在食管癌Eca109單克隆細(xì)胞株中的表達(dá)

1）將克隆的細(xì)胞株分別用0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化，制成單細(xì)胞懸液，吸取6000～8000個(gè)細(xì)胞接種至放有蓋玻片的6孔板中。

2）隔日加4%多聚甲醛固定，沖洗干凈后用30%H2O2與純甲醇的混合液滅火內(nèi)源性過氧化物酶。

3）蒸餾水泡洗（2min／次×3）后滴加山羊血清封閉液封閉20min。

4）滴加稀釋好的一抗，放置4℃冰箱過夜。

5）PBS溶液泡洗（2min／次×3）后滴加第二抗體，于濕盒中37℃孵育30min。

6）PBS溶液泡洗（2min／次×3）后加DAB液進(jìn)行顯色反應(yīng)，適時(shí)用流水沖洗即終止顯色反應(yīng)。7）用蘇木素染液復(fù)染胞核約2min。8）脫水、透明、封固。顯微鏡觀察。

1．2．3 MTT法測細(xì)胞增殖情況

1）單克隆Eca109細(xì)胞的接種和培養(yǎng)，分別取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用含10%FBS的高糖DMEM稀釋為1×104／mL。

2）以每孔100μL接種于96孔板中，然后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

3）每孔加20μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。

4）吸棄每孔內(nèi)液體后加100μL DMSO，震蕩10min，待細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解。

5）設(shè)空白對(duì)照組調(diào)零后，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），連續(xù)監(jiān)測7d，記錄結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，描繪細(xì)胞生長曲線。

1．2．4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

1）取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，終止消化后計(jì)數(shù)。

2）以300個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每個(gè)細(xì)胞株設(shè)2個(gè)復(fù)孔，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，置37℃5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，靜置2周。

3）當(dāng)孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液浸洗2次。

4）加4%多聚甲醛固定15min，然后去固定液，加適量的蘇木素染液染5－10min，最后流動(dòng)水緩慢洗去染液，空氣干燥。

5）顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率＝（克隆數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1．2．5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

1）包被基質(zhì)膠。用50mg／L Matrigel 1∶5稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。

2）水化基質(zhì)膠。吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加60μL含10g／L BSA的無血清培養(yǎng)液，37℃30min。

3）制備細(xì)胞細(xì)胞懸液。用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，每孔接種1×105，上室加100μL無血清培養(yǎng)液，下室加600μL含20%FBS的培養(yǎng)液，去除氣泡，培養(yǎng)48h。

4）用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，蘇木素染色15－20min，伊紅染2min隨機(jī)選取5個(gè)200×視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2．1 食管癌Eca109單克隆細(xì)胞株的形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下Eca109細(xì)胞形態(tài)（圖1），未克隆分選的Eca109細(xì)胞呈多種形態(tài)，大多數(shù)為短梭形，核圓，胞漿豐富，少數(shù)為圓形和多角形，核大漿少（圖1a）；單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)增法將圓形（圖1b）和短梭形細(xì)胞（圖1c）分離出來。HE染色Eca109細(xì)胞見圖2。

2．2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測

在Eca109單克隆細(xì)胞株中Oct－4均陽性表達(dá)，未克隆分選的Eca109細(xì)胞既有核表達(dá)也有漿表達(dá)（圖3a），在圓細(xì)胞株定位于胞核，呈棕褐色（圖3b），短梭形細(xì)胞株定位于胞漿，呈淺黃色，表達(dá)較弱（圖3c）。

在Eca109單克隆細(xì)胞株中P75NTR均陽性表達(dá)，未克隆分選的Eca109細(xì)胞有核表達(dá)也有漿表達(dá)（圖4a），圓細(xì)胞株中定位表達(dá)于胞核，呈棕褐色（圖4b），短梭形細(xì)胞株定位表達(dá)于胞漿，呈淺黃色（圖4c）。

2．3 Eca109單克隆細(xì)胞株的增殖情況

用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）分別檢測未克隆細(xì)胞、克隆后圓細(xì)胞和短梭形細(xì)胞連續(xù)7d的增殖情況，檢測數(shù)據(jù)采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用方差分析，結(jié)果見表1和圖5。

由表1和圖5可知：3組細(xì)胞株組間差異非常顯著P＝0．000，F(xiàn)＝52．345。組間兩兩比較，圓細(xì)胞株和短梭細(xì)胞株組之間P＜0．05，未克隆細(xì)胞與短梭形細(xì)胞株組之間P＜0．05，7d之間細(xì)胞抑制率相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0．05。

2．4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

重復(fù)3次平板克隆，經(jīng)染色計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)圓形細(xì)胞克隆率明顯高于梭短細(xì)胞和未克隆細(xì)胞，且克隆團(tuán)大而圓（圖6）。

檢測數(shù)據(jù)采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用方差分析，結(jié)果見表2。

由表2可知：3組細(xì)胞株組間克隆率差異非常顯著P＝0．000，F(xiàn)＝68．253。組間兩兩比較，圓細(xì)胞株和短梭細(xì)胞株組之間P＜0．05，未克隆細(xì)胞組與短梭形細(xì)胞株組之間P＜0．05，圓形細(xì)胞株和未克隆細(xì)胞組之間P＜0．05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)，以48h穿過Matrigel基質(zhì)膠到達(dá)濾膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力的大小，結(jié)果顯示3種細(xì)胞株的侵襲能力差異不大，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

3 討論

P75NTR是神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族（TNGF）的成員之一，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)及眾多非神經(jīng)系統(tǒng)的組織及腫瘤細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)P75NTR參與調(diào)節(jié)多種系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生以及惡性進(jìn)展，并都有陽性表達(dá)。孫志剛等［4］應(yīng)用P75NTR對(duì)人食管腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分選，發(fā)現(xiàn)P75NTR陽性細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性。Huang等［5］采用無血清培養(yǎng)法富集食管癌干細(xì)胞，P75NTR細(xì)胞的比例高達(dá)68．3%，與常規(guī)培養(yǎng)下的0．32%～3．25%相比，差異有顯著性。

Oct－4是一種公認(rèn)的干細(xì)胞表面標(biāo)志物，它在干細(xì)胞中既能控制干細(xì)胞向特定細(xì)胞類型分化，又可以維持干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)并促進(jìn)細(xì)胞不斷增殖，近年發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤組織中有表達(dá)，而且在口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中高表達(dá)［6］。

前期本課題組許健等［3］發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞后，存在P75NTR、Oct－4核陽性表達(dá)細(xì)胞增多的現(xiàn)象，這表明此類細(xì)胞具有很強(qiáng)的耐藥性，推測有可能是食管癌干細(xì)胞。因此，本研究組將通過對(duì)人食管癌Eca109細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)獲得不同的細(xì)胞株，觀察發(fā)現(xiàn)存在兩種形態(tài)的細(xì)胞亞型，即小圓形和短梭形。通過免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)兩種亞型的細(xì)胞進(jìn)行P75NTR、Oct－4的表達(dá)定位觀察，發(fā)現(xiàn)小圓細(xì)胞P75NTR、Oct－4均在細(xì)胞核表達(dá)，并且隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其核陽性表達(dá)的細(xì)胞有所減少，形態(tài)也發(fā)生了變化，由圓形逐漸變?yōu)樗笮?，說明其具有分化產(chǎn)生其他表型的能力。MTT法和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測小圓細(xì)胞，短梭細(xì)胞和未克隆分選的Eca109細(xì)胞的體外增殖能力，發(fā)現(xiàn)小圓細(xì)胞的增殖速度明顯快于其他兩組細(xì)胞（P＜0．001），但細(xì)胞侵襲能力卻沒有多大差異，這可能與細(xì)胞分化變性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P75NTR、Oct－4核陽性表達(dá)的小圓形Eca109細(xì)胞符合假定的食管癌干細(xì)胞的特性，提示在此亞群細(xì)胞中可能有干細(xì)胞存在。但其他體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測干細(xì)胞的特性如自我更新能力、致瘤能力還未進(jìn)行，在以后的研究中我們將聯(lián)合以上干細(xì)胞特性對(duì)P75NTR、Oct－4核陽性表達(dá)的小圓形Eca109細(xì)胞進(jìn)行鑒定，這將為能否分離與鑒定出食管癌腫瘤干細(xì)胞和臨床食管癌的治療等相關(guān)性研究奠定良好的基礎(chǔ)。

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