不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞TfR與Lf的表達(dá)

李微，董偉杰，劉云霞，庹清章，劉丹霞，張萬江

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)免疫學(xué)教研室／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

鐵元素對巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生存有重要作用，但三者的相互作用機(jī)制尚不十分清楚，本實(shí)驗(yàn)通過檢測不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin receptor，TfR ）和乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）的表達(dá)含量，闡明結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞激活了巨噬細(xì)胞鐵－轉(zhuǎn)鐵蛋白－轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合鐵的途徑和乳鐵蛋白參與的非轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合鐵的途徑，使巨噬細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，從而影響結(jié)核分枝桿菌的存活及繁殖，旨在為闡明預(yù)防結(jié)核病發(fā)病的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)菌

結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv株和卡介苗菌BCG株由中國藥物生物制品檢定所提供。

1．1．2 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264．7購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1．1．3 主要材料及來源

DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（美國 Hyclone公司）；臺盼蘭（美國Sigma公司）；小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司）；小鼠乳鐵蛋白ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司）；兔抗小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體（Epitmics公司）；HRP山羊抗兔二抗（北京康為生物有限公司）。

1．2 方法

1．2．1 結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞模型建立

H37Rv菌株用0．5mL的生理鹽水和蘇通培養(yǎng)液混合液（體積比為1∶3）稀釋，BCG疫苗每支用0．5mL的專用稀釋液稀釋，接種于羅氏培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)至生長達(dá)對數(shù)期時(shí)，取生長狀態(tài)良好的H37Rv菌株，放于磨菌器中，加少量含0．05%Tween－80的生理鹽水研磨均勻，用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）稀釋成菌懸液，調(diào)整細(xì)菌濃度為1．0×107／mL。然后用完全培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)RAW264．7細(xì)胞，0．25%的胰蛋白酶消化并收獲細(xì)胞，加入臺盼蘭染色做活細(xì)胞測定，觀察活細(xì)胞比率＞95%。

顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1．0×106／mL。取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加2mL細(xì)胞懸液，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h；移去培養(yǎng)液，用預(yù)溫的不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板2次，去除非貼壁細(xì)胞；每孔加2mL細(xì)菌懸液，使細(xì)菌與巨噬細(xì)胞的比例為10∶1，培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型隨機(jī)分為H37Rv組、BCG組、空白對照組。

1．2．3 ELISA技術(shù)動態(tài)檢測巨噬細(xì)胞上清液中TfR和Lf表達(dá)量

于模型建立后1、6、12、18、24h分別收集細(xì)胞上清液，在4℃離心機(jī)中10000r／min離心10min。

1．2．4 ELISA技術(shù)檢測TfR的表達(dá)量

按照小鼠ELISA轉(zhuǎn)鐵蛋白受體試劑盒進(jìn)行操作。按50、40、30、20、10、0ng／mL配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入到酶標(biāo)測定板中，100μL／孔。其他孔加入相同體積的待測上清樣品，酶標(biāo)板加蓋，37℃反應(yīng)40 min，洗滌5次，每孔加50μL生物素抗小鼠鐵蛋白工作液，37℃反應(yīng)20min，洗滌3次，加酶標(biāo)抗體工作液100μL／孔，37℃反應(yīng)10min，洗滌5次，再加TMB顯色液，90μL／孔，37℃避光反應(yīng)20min，最后加TMB終止液，100μL／孔，酶標(biāo)儀450nm波長下讀取各孔吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本的鐵蛋白含量。

1．2．5 ELISA技術(shù)檢測Lf的表達(dá)量

操作步驟同TfR的測定，但標(biāo)準(zhǔn)工作液按100、50、25、10、5、0ng／mL進(jìn)行配置。

1．2．6 Western blot技術(shù)動態(tài)檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)TfR的表達(dá)量

提取細(xì)胞總蛋白：于模型建立后1、6、12、18、24 h分別提取細(xì)胞內(nèi)的總蛋白。將6孔板中營養(yǎng)液吸干凈后，每孔加100μL的SDS蛋白裂解液，冰上裂解30min，而后用小刮子將其刮出，水中煮沸15 min，4℃離心16min，取上清。核酸蛋白測定儀模式調(diào)至A280，測定總蛋白的濃度，以濃度最小的所在組蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用裂解液稀釋，使得各組蛋白濃度一致。將蛋白質(zhì)上樣緩沖液5μL與蛋白液20μL混勻，然后在水中煮沸10min，冰上冷卻5min。

聚丙烯電泳：離心機(jī)上4℃13000r／min離心上樣液體，5min，取上清上樣，80V，30min恒壓電泳，待溴酚藍(lán)遷移至分離膠后改為110V，90min恒壓電泳。

轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜前將裁剪好的PVDF膜放在甲醇中浸泡3min，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，將 Walkman濾紙泡入轉(zhuǎn)膜液約15min。以 Walkman濾紙、聚丙酰胺凝膠、PVDF膜、Walkman濾紙的順序，23V，恒壓半干轉(zhuǎn)膜83min后，將PVDF膜置入含50g／L脫脂奶粉的TBS－T中，封閉2h。

孵一抗：將PVDF膜放入兔源性抗TfR抗體TBS－T 溶液中（1∶1000）4℃孵育過夜。次日：TBST洗滌PVDF膜，10min／次，共3次。PVDF膜放入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG的二抗中（1∶40000），室溫孵育1h。TBS－T 洗膜3次，10min／次，用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行發(fā)光顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照，用Quantity one軟件進(jìn)行分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS16．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所得數(shù)據(jù)均以（ˉX±S）表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 小鼠巨噬細(xì)胞上清液中TfR蛋白表達(dá)水平

結(jié)果見圖1。

圖1 顯示，TfR在正常對照組中有少量表達(dá)。3個(gè)組在1、6、12、18h表達(dá)逐漸增強(qiáng)，24h下降。同一時(shí)間點(diǎn)H37Rv組、BCG組TfR的表達(dá)均高于正常對照組，在12、18h差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。BCG組與 H37Rv組比較，H37Rv組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞上清液中TfR表達(dá)略高于BCG組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞可以增強(qiáng)TfR的表達(dá)。

2．2 小鼠巨噬細(xì)胞上清液中Lf蛋白表達(dá)水平

結(jié)果見圖2。

由圖2可知，正常巨噬細(xì)胞分泌少量的Lf，但在各時(shí)間點(diǎn)檢測表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，同一時(shí)間點(diǎn)各組比較，結(jié)果表明，H37Rv組、BCG組的表達(dá)均高于正常對照組，在6、12、18、24h均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），其中24h差異最大。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BCG組與H37Rv組比較，H37Rv組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞上清液中Lf表達(dá)略高于BCG組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此表明，感染增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞Lf的分泌。

2．3 小鼠巨噬細(xì)胞中TfR蛋白表達(dá)水平

結(jié)果如圖3所示。

圖3和圖4顯示，用 Western blot檢測各組小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi) TfR在1、6、12、18、24h的蛋白表達(dá)水平，在分子質(zhì)量單位約95Kd處各有1條特異性蛋白帶，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表達(dá)結(jié)果為：H37Rv組＞BCG組＞正常對照組，且在1、6、18h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。提示結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)TfR的表達(dá)增高，且表達(dá)與毒力相關(guān)，毒力越強(qiáng)TfR表達(dá)越高。

3 討論

人的單核細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）介導(dǎo)的途徑來獲取轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）結(jié)合的。TfR1是1個(gè)跨膜的二聚糖蛋白，每個(gè)亞基結(jié)合1個(gè)Tf（Fe3＋）2后內(nèi)吞形成內(nèi)吞小泡，在內(nèi)吞小泡里Fe3＋被釋放出來。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞后，TfR1的表達(dá)顯著增加。細(xì)胞內(nèi)的鐵水平與TfR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制為：細(xì)胞內(nèi)鐵水平調(diào)控TfR1的表達(dá)主要是通過鐵反應(yīng)元件 （iron－responsiveelement，IRE）和鐵調(diào)節(jié)蛋白 （iron－regulatory protein，IRP）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控來調(diào)節(jié)，IRP能夠感受細(xì)胞內(nèi)游離鐵水平的變化，通過與IRE的結(jié)合或解離來調(diào)節(jié)具有IRE結(jié)構(gòu)的鐵代謝相關(guān)蛋白mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)量。TfR1mRNA 3′－UTR含有5個(gè)IREs，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏時(shí)，IRP與TfR1mRNA 3′－URT 的IRE 結(jié)合，減少了TfRmRNA的降解，TfR表達(dá)量增加。反之，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵水平增加時(shí)，則出現(xiàn)相反的結(jié)果［1－2］。

Chart報(bào)道，活化的小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO能有效殺死致病的結(jié)核分枝桿菌。在炎癥應(yīng)答反應(yīng)中，iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO，當(dāng)NO合成增加時(shí)，活化IRP，使之與IRE結(jié)合，增加了TfR的表達(dá)，降低了Fn的合成，通過增加鐵攝取，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鐵濃度上升。巨噬細(xì)胞還可以通過膜上TfR1介導(dǎo)內(nèi)吞作用，吸收轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵（transferrin bound iron，TBI）；在一些促炎癥因子刺激下，二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體 （Divalent metal transporter1，DMT1）表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵（nontransferrin bound iron，NTBI）的吸收［3］。在感染早期TFR1的上調(diào)是由翻譯后調(diào)節(jié)介導(dǎo)的，并隨著IRP1和IRP2表達(dá)的增加而增加。TFR1表達(dá)的增加通過轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的鐵運(yùn)輸擴(kuò)充了細(xì)胞內(nèi)動態(tài)鐵池，使弗朗西斯菌易于獲取鐵［2］。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的下調(diào)不影響細(xì)菌與其他膜蛋白的結(jié)合而入侵，但抑制細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖。

本實(shí)驗(yàn)利用ELISA技術(shù)和 Western blot技術(shù)動態(tài)監(jiān)測不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞TfR的表達(dá)，結(jié)果顯示感染誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞TfR的表達(dá)，即驅(qū)動了轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的鐵吸收程序。另外，本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染后，巨噬細(xì)胞內(nèi)Fn在1、6、12、18、24h表達(dá)逐漸增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。Western blot結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞內(nèi)的TfR與毒力呈正相關(guān)，毒力越強(qiáng)TfR表達(dá)越高。分析可能與不同毒力的MTB感染巨噬細(xì)胞后可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)歸有關(guān)：高毒力結(jié)核菌株 H37Rv能夠抑制細(xì)胞凋亡，在胞內(nèi)存活、繁殖、擴(kuò)散，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)菌擴(kuò)散，而H37Ra、BCG等減毒株則能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量凋亡［4］。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）是一種分子量為70－80KD的糖蛋白，是高親和性的鐵結(jié)合蛋白，在巨噬細(xì)胞中參與非轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合鐵的途徑來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鐵代謝［5］。乳鐵蛋白分子中含有2個(gè)六配位金屬結(jié)合位點(diǎn)，可牢固結(jié)合2個(gè)鐵離子，多余鐵離子是與乳鐵蛋白靠靜電力作用結(jié)合。人的小腸粘膜細(xì)胞表面有特殊乳鐵蛋白受體（Lactoferrin Receptor，LfR）與乳鐵蛋白結(jié)合，當(dāng)乳鐵蛋白到達(dá)腸道后，識別并特異結(jié)合細(xì)胞表面LfR，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部釋放出Fe3＋。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺鐵時(shí)，細(xì)胞表面LfR增多，從而增加乳鐵蛋白與其受體結(jié)合機(jī)會，在補(bǔ)充鐵時(shí)結(jié)合使用乳鐵蛋白不僅可降低有效鐵使用量，也可避免游離鐵對腸道直接刺激作用，鐵的這種高吸收性主要在于乳鐵蛋白鐵的高溶解性或Fe－Lf中鐵的特殊吸收機(jī)制［6］。

乳鐵蛋白具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性和刺激淋巴細(xì)胞合成的能力，機(jī)體感染時(shí)會產(chǎn)生6～20倍以上的乳鐵蛋白參與抗菌過程。張英華等［7］研究在磷酸根存在中性條件下乳鐵蛋白對鐵離子溶解作用影響，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白對二價(jià)鐵和三價(jià)鐵均具有顯著增溶作用，可使鐵溶解度提高60～70倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其分子含鐵量。另有結(jié)果表明，乳鐵蛋白不僅可顯著增加無機(jī)鐵離子在腸道環(huán)境條件下溶解度，且由于乳鐵蛋白中鐵的高穩(wěn)定性及其以氨基酸鐵形式被吸收的特殊吸收方式，使其必然能促進(jìn)機(jī)體對鐵的吸收。

Lf是鐵結(jié)合性糖蛋白，它可以與病原性微生物競爭性地結(jié)合鐵離子，因?yàn)椴≡亩拘耘c其從環(huán)境中獲取鐵離子有關(guān)。除乳酸桿菌外，幾乎所有細(xì)菌的生長都需要鐵，鐵離子對細(xì)菌中生物氧化酶是必需的Lf與之競爭鐵造成微生物生長的鐵缺乏環(huán)境，從而導(dǎo)致病原微生物的死亡［8］。缺鐵型Lf（apo－lactoferrin）即通過與需鐵細(xì)菌爭奪可利用鐵而達(dá)到抑菌的目的。乳鐵蛋白表達(dá)量增高可增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞對微生物的吞噬和對胞內(nèi)寄生菌的殺傷作用，主要作用機(jī)制分為兩種：（1）脫鐵形式的乳鐵蛋白，通過結(jié)合鐵離子，抑制被吞噬細(xì)菌在胞內(nèi)生長，從而促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞對細(xì)菌的殺傷；（2）在胞內(nèi)吞噬溶酶體中的酸性環(huán)境條件下，鰲合鐵離子的乳鐵蛋白，可通過提供游離鐵離子，催化自由基的生成，從而對吞噬溶酶體內(nèi)的微生物產(chǎn)生殺傷作用［9］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ELISA技術(shù)動態(tài)監(jiān)測1h－24h內(nèi)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)Lf蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：H37Rv組、BCG組的表達(dá)量均高于正常對照組，提示感染激活了非轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合鐵的途徑，使得細(xì)胞內(nèi)的鐵增多，與上述結(jié)果一致。推測結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞后，大量表達(dá)Lf可能殺傷寄生在宿主內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，這為防治結(jié)核病提供個(gè)新的思路。

結(jié)核桿菌感染宿主巨噬細(xì)胞后，一方面要從感染宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)攝取一定量的鐵，以保證自身在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存、繁殖和分化的需要，使得巨噬細(xì)胞內(nèi)的游離鐵離子減少，此時(shí)巨噬細(xì)胞攝鐵途徑鐵－轉(zhuǎn)鐵蛋白－轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合鐵的途徑和乳鐵蛋白參與的非轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白結(jié)合鐵途徑被激活，同時(shí)細(xì)胞膜上的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ferroportin，F(xiàn)PN）轉(zhuǎn)出途徑被抑制［10］，使得巨噬細(xì)胞內(nèi)的Fn的表達(dá)量上升。這為結(jié)核分枝桿菌生的生存提供了足夠的鐵元素；另一方面，細(xì)胞中鐵過載，超過了鐵蛋白的結(jié)合能力，使游離鐵在鐵池中大幅度增加，通過與細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)化合物結(jié)合，產(chǎn)生高反應(yīng)鐵或高鐵離子，進(jìn)而損傷溶酶體膜和線粒體膜；并且鐵可作為一種強(qiáng)力催化劑，促進(jìn)氧自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜磷脂過氧化反應(yīng)，特別是對線粒體膜和微粒體膜的過氧化損傷，進(jìn)而通過干擾電子轉(zhuǎn)移等而導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞的應(yīng)激和／或凋亡或死亡［11－12］。所以，研究不同毒力的結(jié)核桿菌對感染宿主巨噬細(xì)胞鐵代謝的調(diào)控作用機(jī)制，對結(jié)核病的有效防治提供了新的理論依據(jù)，對結(jié)核病的防治有重要的意義。

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