絹蒿水煎劑對正常小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究

王榮，剡根強，王靜梅，段海豐，刑偉元，萬鵬

（石河子大學動物科技學院，石河子832003）

絹蒿（（Serphidium（Bess）Poljak）屬菊科蒿屬植物，是新疆分布較廣，牛羊喜食的一種蒿屬牧草［1－2］。絹蒿和藥用植物青蒿同屬于蒿屬植物，已有的研究表明，絹蒿與青蒿均含有豐富的萜類化合物及芳香族化合物。從青蒿植物提取的青蒿素不僅是抗虐特效藥，同時還具有免疫調(diào)節(jié)作用。青蒿素能有效誘導淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化，促進干擾素，白細胞介素的釋放，調(diào)節(jié)巨噬細胞的吞噬功能等作用［3－5］。

目前，但有關(guān)絹蒿牧草是否具有青蒿相似的免疫調(diào)節(jié)作用未見研究報道。為此，本試驗借鑒青蒿的免疫學研究方法，制備絹蒿水煎劑給小鼠灌服，通過檢測小鼠T、B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化、T淋巴細胞的數(shù)量、T淋巴細胞亞群、IFN－γ、IL－2及巨噬細胞吞噬活性等免疫學指標，研究確定絹蒿的免疫生物學活性，旨在為進一步開發(fā)具有營養(yǎng)與保健雙重作用的植物飼用添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗動物

昆明小白鼠，6周齡，體重（20．0±2．0）g，石河子大學實驗動物中心提供。

1．1．2 試驗藥物

絹蒿牧草，采自石河子南山草場5－7月絹蒿莖葉，陰干待用。

1．1．3 主要儀器與試劑

灌胃針；Power Wave XS2 連續(xù)波長酶標儀（BioTek）；CD4＋T ELISA 試劑盒、CD8＋T ELISA試劑盒、IFN－γELISA 試劑盒、IL－2ELISA 試劑盒均購于上海藍基生物科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 水煎劑的制備，試驗動物分組及給藥方式

取絹蒿干草，經(jīng)切片機粗粉，粉碎機細粉后，于不銹鋼鍋中煎煮［6］。合并的煎液置干燥箱80℃溫度下濃縮成每毫升相當于原絹蒿生藥約1g的藥液。用時以蒸餾水稀釋為所需濃度，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

選取90只小鼠，稱重后隨機分成3組，即正常對照組（蒸餾水）；低濃度組（800mg／kg）和高濃度組（2000mg／kg），均采用灌胃給藥，0．4 （mL／次）／只，連用10d。

1．2．2 絹蒿水煎劑對小鼠T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的測定

T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗［7］：采用ConA作為刺激劑。制備脾淋巴細胞懸液，加入到96孔培養(yǎng)板，100 μL／孔，然后加入使每孔最終濃度為5μg／mL的ConA液，100μL／孔，每個樣設(shè)3個重復，且重復做4塊細胞培養(yǎng)板。將板置培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）分別培養(yǎng)24、48、72和96h。培養(yǎng)過程中隔3～8h震蕩培養(yǎng)板1次。MTT比色法檢測細胞增殖結(jié)果，酶標儀測OD值，測定波長570nm。

B淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：采用LPS作為刺激劑。試驗方法同T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，其中LPS液最終濃度為10μg／mL。

1．2．3 絹蒿水煎劑對小鼠T淋巴細胞數(shù)量（ANAE）的測定

采集小鼠抗凝血，按酸性α－醋酸萘酯酶（ANAE）染色法染色［8］。

1．2．4 絹蒿水煎劑對小鼠外周血T細胞亞群的測定

小鼠采血分離血清。CD4＋、CD8＋T數(shù)量測定按ELISA試劑盒說明檢測，其中被檢樣品、空白對照和標準曲線做各重復3孔。

1．2．5 絹蒿水煎劑對小鼠巨噬細胞吞噬功能的測定

灌胃第8天，小鼠腹腔注射6%的淀粉溶液1．0 mL／只。中性紅法檢測巨噬細胞吞噬功能，酶標儀于520nm波長測吸光度，以吸光度值大小表示巨噬細胞攝取中性紅的能力強弱，結(jié)果以酶標儀A值表示［9］。

1．2．6 絹蒿水煎劑對小鼠IFN－γ、IL－2的測定

小鼠采血分離血清。IFN－γ和IL－2的測定按ELISA試劑盒說明檢測，其中被檢樣品、空白對照和標準曲線做各重復3孔。

1．3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計學處理后數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ˉx±S）表示。組間差異采用t檢驗。P＜0．05為差異顯著，P＜0．01為差異極顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2．1 絹蒿水煎劑對T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響

如圖1、2所示，從48h開始，三組試驗組T、B淋巴細胞增殖均明顯；72h時絹蒿水煎劑高濃度組和低濃度組的T、B淋巴細胞增殖程度均達到最大；96h時絹蒿水煎劑高濃度組和低濃度組的T、B淋巴細胞增殖程度均無明顯變化。

如表1所示，絹蒿水煎劑高濃度組的T淋巴細胞增殖程度明顯高于對照組（P＜0．01）；絹蒿水煎劑低濃度組的T淋巴細胞增殖程度高于對照組（P＜0．05）；絹蒿水煎劑高濃度組的T淋巴細胞增殖程度接近低濃度組（P＞0．05）。絹蒿水煎劑高濃度組的B淋巴細胞增殖程度高于對照組（P＜0．05）。

2．2 絹蒿水煎劑對小鼠免疫指標的影響

2．2．1 絹蒿水煎劑對T淋巴細胞數(shù)量的影響

如表1所示，絹蒿水煎劑高低濃度組的小鼠T淋巴細胞ANAE陽性率均顯著高于對照組（P＜0．01）；絹蒿水煎劑高低濃度組間的T淋巴細胞ANAE陽性率差異不顯著（P＞0．05）。

2．2．2 絹蒿水煎劑對T淋巴細胞亞群數(shù)量的影響

如表1所示，絹蒿水煎劑低濃度組的CD4＋T，CD8＋T含量均高于對照組（P＜0．05）；絹蒿水煎劑高濃度組的CD4＋T，CD8＋T含量均比對照組低，差異不顯著（P＞0．05）

2．2．3 絹蒿水煎劑對巨噬細胞吞噬功能的影響

絹蒿水煎劑低濃度組巨噬細胞吞噬能力稍高于對照組，差異不顯著（P＞0．05）；絹蒿水煎劑高濃度組的巨噬細胞吞噬能力略低于對照組，差異不顯著（P＞0．05）。

2．2．4 絹蒿水煎劑對小鼠IFN－γ、IL－2含量的影響

絹蒿水煎劑低濃度組IFN－γ含量高于對照組（P＜0．05）；高濃度組IFN－γ含量明顯低于對照組（P＜0．01）；絹蒿水煎劑低濃度組IL－2含量明顯高于對照組（P＜0．01）；絹蒿水煎劑高濃度組IL－2含量略低于對照組，差異不顯著（P＞0．05）。

3 討論

絹蒿水煎劑對小鼠T、B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，T淋巴細胞亞群數(shù)量，IFN－γ、IL－2含量的影響與青蒿具有相似性。其原因：青蒿素是從菊科植物蒿屬中提取的倍半萜內(nèi)酯，絹蒿屬作為蒿屬中的一個組或亞屬一直被看作是一個大類群，與青蒿的研究歷史緊密相關(guān)；青蒿植物含有豐富的萜類化合物，芳香族化合物，醇、醛、酮類化合物，長鏈脂肪烴［10－11］等成分，與絹蒿成分相似；絹蒿水煎劑對小鼠T，B淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，巨噬細胞吞噬功能的影響與青蒿不完全一致［12－13］，除檢測方法不同外，主要原因可能是所用藥物材料不同。中藥青蒿通常分離提取有效成分進行試驗，而本試驗中采用水煎法保留了牧草絹蒿的全草成分。

T淋巴細胞分化為TDT H細胞，并產(chǎn)生細胞因子，從而發(fā)揮細胞免疫的作用；B淋巴細胞主要作用是對抗原的識別、活化、增殖，分化為漿細胞并分泌抗體［14］，根據(jù)淋巴細胞的轉(zhuǎn)化情況，可判斷機體的細胞和體液免疫水平。本試驗中絹蒿水煎劑對T、B細胞的轉(zhuǎn)化能力具有上調(diào)作用，因此絹蒿制劑可能具有提高機體細胞免疫，體液免疫作用。巨噬細胞是主要的炎性反應調(diào)節(jié)細胞和抗原提呈細胞，在炎性反應過程中分泌不同的細胞因子（IL－1、IL－6、IL－10、TNF）和趨化因子等，間接或直接地參與各種炎性反應過程［15］。本試驗中高濃度絹蒿水煎劑對小鼠的巨噬細胞具有下調(diào)作用，因此絹蒿制劑可能具有緩解炎性反應作用，這為絹蒿制劑在超敏反應，免疫應激中的應用提供了試驗依據(jù)。

絹蒿水煎劑低濃度組對T淋巴細胞亞群數(shù)量，巨噬細胞吞噬功能，IFN－γ、IL－2含量具有上調(diào)作用，高濃度組具有下調(diào)作用，這與多數(shù)免疫調(diào)節(jié)劑的特性一致，表明絹蒿對機體免疫功能的影響具有劑量依賴性［16］。提示，在今后的試驗和臨床研究中考慮絹蒿劑量的選擇。

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